香菇多糖对小鼠骨髓树突状细胞表型和功能的影响

胡婷婷，孟一鸣，单风平

(中国医科大学免疫学教研室，辽宁 沈阳 110001)

香菇多糖(Lentinan，LNT)是香菇子实体提取物中的主要有效成分之一，是1969年 Chihara等［1］首次从香菇中分离出的具有抗肿瘤活性的多糖。研究发现，LNT具有多种药理学作用，是一种兼有抑制肿瘤和提高免疫功能的多糖类生物反应调节剂［2］。LNT可以增强巨噬细胞的吞噬功能，激活T淋巴细胞释放活化因子，提高NK细胞活性，诱导干扰素或白细胞介素等细胞因子的产生［3］。树突状细胞(dendritic cells，DCs)是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)，具有独特的抗原递呈和激活功能;作为免疫反应的核心和关键，在肿瘤细胞和T淋巴细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用［4］。本研究利用LNT作用于小鼠骨髓源树突状细胞(bone marrow dendritic cells，BMDCs)，进一步观察 LNT的免疫活性及其对DCs的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性C57BL/6小鼠，6～8周，购自中国医科大学实验动物中心。

1.1.2 药物和主要试剂 香菇多糖(商品名为天地欣)购自南京绿叶思科药业有限公司;IL-12、IL-10和 TNF-α ELISA 试剂盒(eBioscience)，MHCⅡ抗体、CD40抗体、CD83抗体、CD86抗体、CD80抗体和DEC205抗体(BD Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓来源的树突状细胞的培养 取6～8周龄C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死，于75%酒精中浸泡10～15 min，无菌手术取出四肢放入75%酒精中，剔去肌肉，剪掉骨头两端，用1 mL无菌注射器吸取RPMI1640反复冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，1500 r/min离心6 min，倒掉上清，加入1～2 mL红细胞裂解液1～2 min，用PBS洗3遍后重悬于含双抗和10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养液中，接种于6孔板，24 h后弃去未贴壁细胞，再加入含 GM-CSF、IL-4、双抗和10%FCS的RPMI1640，每隔1 d取出半量培养液再加入等量的含 GM-CSF、IL-4、双抗和 10%FCS的RPMI1640培养液，培养至对数期，加药刺激。

1.2.2 药物处理 LNT溶解于RPMIl640中，使LNT浓度为50 μg/mL，然后加入培养至对数生长期的BMDCs细胞培养液中，用RPMI1640培养作为空白对照组，10 ng/mL的LPS(Sigma)刺激培养作为阳性对照。

1.2.3 酸性磷酸酶活性检测 BMDCs经药物处理后培养48 h，再用胰酶消化成细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/mL，按照酸性磷酸酶试剂盒(南方建成生物工程研究所)提供方法操作。

1.2.4 免疫荧光标记和流式细胞仪检测 BMDCs经药物作用48 h后，用胰酶消化为细胞悬液，用FACS缓冲液(含2%FCS的PBS)洗1次，1500 r/min离心6 min，调整细胞浓度1×106个/mL，每管加0.1 mL细胞悬液，加 PE标记的 MHCⅡ和CD40，FITC 标记的 CD83、CD86、CD80 和 DEC205单克隆抗体，4℃避光温育30 min，用FACS缓冲液洗3遍，然后用300 μL FACS缓冲液重悬细胞置于流式细胞仪(FACScan B.D.)检测。

1.2.5 吞噬试验 实验过程要求无菌操作，细胞处理步骤同 1.2.4，加入 FITC-dextran抗体，4℃避光温育2 h，37℃避光温育1 h，用FACS缓冲液洗3遍，然后用300 μL FACS缓冲液重悬细胞置于流式细胞仪(FACScan B.D.)检测。

1.2.6 细胞因子检测 BMDCs经药物作用48 h后收集上清，应用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养液上清中IL-12、IL-10和TNF-α的含量，试验按照购买的ELISA试剂盒的步骤操作。反应终止后用酶标仪检测450 nm吸光值(A450)，再根据标准曲线确定所测细胞因子的浓度。

2 结果与分析

2.1 LNT对酸性磷酸酶活性的影响

BMDCs经药物LNT刺激培养48 h后，检测酸性磷酸酶活性。50 μg/mL的 LNT((78.73±3.14)U/gpmt)和 LPS((65.66 ±1.07)U/gpmt)组与 RPMI1640((94.18 ±1.35)U/gpmt)对照组相比酸性磷酸酶活性下降(P＜0.01)，见图1。

图1 LNT下调BMDCs酸性磷酸酶活性Fig.1 LNT depress the activity of acid phosphatase of BMDCs

2.2 LNT 对 DC MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205表达的影响

BMDCs经药物LNT刺激培养48 h后，流式细胞仪检测 DC 表面 MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205的表达情况见图2。表明50 μg/mL 的 LNT 能够上调 MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86 和 DEC205 的表达(P ＜0.01)，即50 μg/mL的LNT能够促进DC表型的成熟。

图2 LNT能够上调BMDCs表面 MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86和DEC205的表达Fig.2 LNT enhance the expression of MHCⅡ，CD40，CD83，CD80，CD86 and DEC205 molecules on the BMDCs surface

2.3 LNT抑制DC对FITC-dextran的吞噬

BMDCs经药物LNT刺激培养48 h后，再加入FITC-dextran后4℃避光温育2 h，再37℃避光温育1 h，在流式细胞仪上检测阳性细胞的百分比，以此百分比代表DC吞噬FITC-dextran的量，反映DC摄取抗原的能力。经过LNT和LPS处理过的DC阳性细胞所占比例分别是(46.86±5.99)%和(43.53 ±6.29)%，比空白对照组(即RPMI1640组)的(59.82±1.67)%明显降低(P ＜0.05)(见图 3)。

2.4 LNT 对 DC 分泌 IL-12、IL-10 和 TNF-α 的影响

ELISA结果显示 DC的空白对照(即 RPMI1640组)IL-12、IL-10和 TNF-α分泌的量少((33.34 ± 2.61)、(99.75 ± 6.74)、(553.69 ±16.29)pg/mL)，50 μg/mL 的 LNT 和 LPS处理的DC能够分泌高水平的IL-12、IL-10和TNF-α(LNT、LPS 分别为(143.53 ± 20.98)、(496.2 ±17.99)pg/mL;(196.23 ± 2.93)、(437.21 ±13.21)pg/mL;(706.54 ± 13.79)、(835.56 ±21.47)pg/mL，(P ＜0.01))，见图4。

图3 LNT和LPS处理的DC吞噬功能比RPMI1640(即空白对照组)明显降低Fig.3 The ability of unstimulated BMDCs to uptake FITC-dextran was higher than that of LNT-or LPS-treated BMDCs

图4 LNT能够增强BMDCs对IL-12、IL-10和TNF-α的分泌Fig.4 LNT-treated BMDCs secreted higher level of IL-12，IL-10 and TNF-α

3 讨论

LNT具有多种药理学作用，可有效激活T细胞，增强肿瘤患者 Th和 Tc细胞的功能［5］，激活肿瘤坏死因子的产生及巨噬细胞的细胞毒作用，间接杀灭肿瘤细胞［6］。DCs是目前人体内最活跃、功能最强大的专职抗原呈递细胞，参与机体多种自身免疫性疾病、免疫缺陷病、肿瘤及一些炎症反应的病理过程，在机体的抗感染免疫及肿瘤免疫应答过程中起着极其重要的作用。

本实验研究了浓度为50 μg/mL的LNT对小鼠骨髓来源的DCs表型和功能的影响。研究结果显示，50 μg/mL LNT刺激培养48 h后，细胞高表达 MHCⅡ、CD40、CD83、CD80、CD86 和DEC205分子。成熟DCs高表达 MHCⅡ、CD40、CD86和CD80等共刺激分子，CD83是DCs成熟的特征性标志［7］，DEC205是C型凝集素巨噬细胞甘露糖受体家族成员，在淋巴结T细胞区的DCs上高表达［8］，能高效地将抗原加载到 MHCⅡ分子上并提呈给T淋巴细胞［9］，而且细胞对FITC-dextran的吞噬能力下降，细胞趋向成熟;此外，还发现50 μg/mL LNT可使细胞内酸性磷酸酶活性下降，酸性磷酸酶是溶酶体进行细胞内消化的标示酶，其活性下降，说明细胞溶酶体含量减少，间接说明DCs吞噬抗原的能力减弱，细胞趋向成熟。IL-12和IL-10是DCs的自分泌细胞因子［10］，在受到细菌、病毒或其自身表面分子配体的刺激下分泌更明显。IL-12有强大的诱生干扰素的作用，故DCs可通过IL-12介导Th1型免疫反应，促进细胞免疫应答，其含量的增加可进一步促进CD4+T细胞增殖，增强细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)杀伤活性，刺激T细胞和NK细胞产生 IFN-γ，抑制 IgE合成［11］。内源性及外源性IL-10可影响DCs指导Th1/Th2极化，诱导无能/调节T细胞，有助于DCs诱导Th2反应［12］。TNF-α可诱导IFN的产生，与IFN具有协同抗病毒作用，TNF-α具有抗肿瘤、促进 T、B细胞生长等多种生物学活性［13］。IL-12、IL-10和TNF-α 是 mDC 的功能性产物［10，14］，本实验研究结果显示其含量的增高及DCs抗原提呈方面的成熟和表型上的成熟是对应的。

机体抗肿瘤免疫主要依靠CTL的免疫应答来杀伤肿瘤细胞，CTL并不能识别完整的肿瘤抗原分子，只能特异性地识别由MHC分子呈递的抗原多肽。在大部分恶性肿瘤中，肿瘤细胞表面的MHC抗原肽、共刺激分子和黏附分子表达较低，不能有效地诱导T细胞活化，故需要抗原呈递细胞的协同作用［15］，然而功能最强大的专职抗原呈递细胞DCs在肿瘤组织及其周围只有很少的浸润［16］。所以，DCs疫苗治疗肿瘤是一种安全的、有效诱导T细胞反应的免疫疗法，诸多试验也取得了一些疗效［17-19］。

本实验结果表明，LNT能够促进DCs的成熟，提高DCs的抗原提呈能力，刺激DCs高表达共刺激分子，使IL-12、IL-10和 TNF-α等因子分泌量增加，抑制肿瘤的生长。因此，LNT作为DCs治疗肿瘤的免疫佐剂具有重要的临床意义，其在体内对DCs的影响等也值得深入研究。

［1］Chihara G，Maeda Y，Hamuro J，et al.Inhibition of Mouse Sarcoma 180 by Polysaeeharides from LentinusEdodes(Berk)Sing［J］.Nature，1969，222(5194):687-688.

［2］Bisen PS，Baghel RK，Sanodiya BS，et al.Lentinus edodes:A Macrofungus with Pharmacological Activities［J］.Curr Med Chem，2010，17(22):2419-2430.

［3］Xu X，Wang X，Cai F，et al.Renaturation of triple helical polysaccharide lentinan in water-diluted dimethylsulfoxide solution［J］.Carbohydr Res，2010，345(3):419-424.

［4］Xue M，Zhu L，Meng Y，et al.Detailed modulation of phenotypes and functions of bone marrow dendritic cells(BMDCs)by interferon-gamma(IFN-γ)［J］.Int Immunopharmacol，2013，17(2):366-372.

［5］汪继斌，谢毅强，吴贤波.香菇多糖对约氏疟原虫感染小鼠树突状细胞的免疫调节作用［J］.中国病原生物学杂志，2013，8(1):56-58.

［6］丛阳，黄敏.香菇多糖抗肿瘤的基础研究及临床应用进展［J］.大连医科大学学报，2010，32(4):465-469.

［7］Meng Y，Plotnikoff NP，Shan F，et al.Synergistic effect of methionine encephalin(MENK)combined with pidotimod(PTD)on the maturation of murine dendritic cells(DCs)［J］.Hum Vaccin Immunother，2013，9(4):773-783.

［8］Thonur L，Haig DM，Thomson J，et al.Toll-like receptor gene expression in fresh and archived ovine pseudoafferent lymph DEC205+dendritic cells［J］.J Comp Pathol，2012，147(2-3):296-304.

［9］Cheong C，Choi JH，Vitale L，et al.Improved cellular and humoral immune responses in vivo following targeting of HIV Gag to dendritic cells within human anti-human DEC205 monoclonal antibody［J］.Blood，2010，116(19):3828-3838.

［10］Sabado RL，Miller E，Spadaccia M，et al.Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy［J］.J Vis Exp，2013，1:78.

［11］Darlak KA，Wang Y，Li JM，et al.Enrichment of IL-12-producing plasmacytoid dendritic cells in donor bone marrow grafts enhances graft-versus-leukemia activity in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation［J］.Biol Blood Marrow Transplant，2013，19(9):1331-1339.

［12］Huang H，Dawicki W，Lu M，et al.Regulatory dendritic cell expression of MHCII and IL-10 are jointly requisite for induction of tolerance in a murine model of OVA-asthma［J］.Allergy，2013 ，68(9):1126-1135.

［13］Miwa S，Nishida H，Tanzawa Y，et al.Correction:TNF-α and Tumor Lysate Promote the Maturation of Dendritic Cells for Immunotherapy for Advanced Malignant Bone and Soft Tissue Tumors［J］.PLoS One，2013，24:8(10).

［14］Matsuda R，Kezuka T，Nishiyama C，et al.Suppression of murine experimental autoimmune optic neuritis by mature dendritic cells transfected with calcitonin gene-related Peptide gene［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(9):5475-5485.

［15］Kim DS，Kim DH，Goo B，et al.Immunotherapy of malignant melanoma with tumor lysate-pulsed autologous monocyte-derived dendritic cells［J］.Yonsei Med J，2011，52(6):990-998.

［16］Ayari C，LaRue H，Hovington H，et al.High level of maturetumor-infiltrating dendritic cells predicts progression to muscle invasion in bladder cancer［J］.Hum Pathol，2013，44(8):1630-1637.

［17］Perroud MW Jr，Honma HN，Barbeiro AS，et al.Mature antolognus dendritic cell vaccines in advanced non-small cell lung caneer:a phase I pilot study［J］.Exp Clin Cancer Res，2011，30:65.

［18］Kvisthorg P，Beehmann CM，Pedersen AW，et al.Comparison of monocyte-derived dendritic cells from colorectal cancer patients，non-small-cell-lung-cancer patients and healthy donors［J］.Vaccine，2010，28(2):542-547.

［19］Fukushima S，Himta S，Motomura Y，et al.Multiple antigentarged immunotherapy with alpha-galactosylce-ramide-loaded and genetically engineered dendritic cells derived from embryonic stem cells［J］.Immunother，2009，32(3):219-231.