HPLC法测定阿法替尼片的含量

韩忠丽，郝贵周，陈小伟

(鲁南制药集团股份有限公司，山东临沂276006)

阿法替尼(afatinib)为酪氨酸激酶抑制剂类抗癌药［1］，由勃林格殷格翰公司开发。2013年7月美国FDA批准Gilotrif(阿法替尼片)用于表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的晚期(转移性)非小细胞肺癌(NSCL)患者的治疗，EGFR基因突变可通过FDA批准的诊断试剂进行检测。大约85%的肺癌为非小细胞肺癌，使其成为肺癌中最常见的形式。EGFR基因突变在非小细胞肺癌中大约能占到10%，而EGFR基因突变的大多数形式是EGFR外显子19缺失或外显子21 L858R置换［2，3］。本文通过反复研究建立了反相HPLC法测定阿法替尼片含量的方法，结果准确可靠，可用于阿法替尼片质量控制。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪;Sartorius LA120S分析天平，乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾、氢氧化钠为分析纯，水为纯化水。阿法替尼对照品(山东新时代药业有限公司标定，批号:131001S)，阿法替尼原料(山东新时代药业有限公司，批号:130902)。

2 方法与结果

2.1 阿法替尼片的制备［4］称取阿法替尼细粉30 g、微晶纤维素155 g、乳糖100 g、羧甲基淀粉钠12 g，加入湿法混合制粒机混合10 min，加入3%聚维酮k30乙醇溶液制粒，过20目筛;流化床50℃干燥20 min，过20目筛整粒;加入硬脂酸镁3 g，混合5 min;Φ9 mm浅弧冲压片。

2.2 色谱条件 色谱柱:Phenomenex Luna C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:0.02 mol·L－1磷酸二氢钾(2 mol·L－1氢氧化钠溶液调pH 6.0)－乙腈(50∶50);柱温:30℃;检测波长:252 nm;进样量:20 μL。理论板数按阿法替尼峰计算不低于3 000。

2.3 溶液制备

2.3.1 供试品溶液的制备 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中约含阿法替尼0.1 mg的溶液，摇匀，滤过，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备 取阿法替尼对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中约含阿法替尼0.1 mg的溶液，摇匀，即得。

2.3.3 空白辅料溶液的制备 取阿法替尼片空白辅料适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中约相当于含阿法替尼0.1 mg的溶液，摇匀，滤过，即得。

2.4 专属性试验 按“2.2”项下的色谱条件，分别量取对照品溶液、供试品溶液及空白辅料溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，空白辅料对本品的含量测定无干扰，见图1。

图1 液相色谱图

2.5 线性与范围试验 取阿法替尼对照品适量(约相当于阿法替尼50 mg)，精密称定，置50 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。分别精密量取储备液 1、2.5、4、5 和6 mL，置50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按“2.2”项下的色谱条件测定，以峰面积A对浓度C进行线性回归，得回归方程为:A=63.293C+21.339，r=0.999 9。结果表明:阿法替尼浓度在20～120 μg·mL－1范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密称取阿法替尼对照品，加流动相溶解并稀释制成浓度分别约为80、100和120 μg·mL－1的溶液，取上述3 种溶液，按“2.2”项下的色谱条件测定，每份测定3次。记录峰面积，考察精密度，计算 RSD 分别为 0.52%、0.37%、0.39%。

2.7 稳定性试验 取供试品溶液与对照品溶液，分别在配制后0、1、2、4、6、8 h 取样，依法测定，记录峰面积，计算相对标准偏差。经试验，供试品溶液与对照品溶液峰面积的相对标准偏差分别为0.64%与0.51%，说明溶液8 h内稳定性良好。

2.8 回收率试验 精密称取阿法替尼对照品适量(约相当于阿法替尼16、20、24 mg)，各3份，分别置200 mL量瓶中，分别加入处方量的空白辅料适量，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。另精密称取阿法替尼对照品约20 mg，置200 mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按“2.2”项下的色谱条件测定，按外标法以峰面积计算，测定平均回收率为100.3%，RSD 为 0.93%(n=9)。

2.9 样品测定 按“2.1”项下方法分别制备3批样品(批号:131201、131202、131203)，取本品及对照品，按“2.3”项下的方法制备供试品溶液及对照品溶液，精密量取上述供试品溶液及对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，结果见表1。

表1 阿法替尼片含量测定结果

3 讨论

3.1 测定波长的选择 以流动相作为溶剂，配制阿法替尼溶液，在190～400 nm波长范围内进行扫描，结果阿法替尼在252 nm波长处有最大吸收，故检测波长选择为252 nm。

3.2 流动相的选择 调整磷酸二氢钾溶液的浓度、pH值及与乙腈的比例，经反复摸索，最终选用0.02 mol·L－1磷酸二氢钾(2 mol·L－1氢氧化钠溶液调pH 6.0)－乙腈(50∶50)为流动相。经试验，该方法主峰保留时间适中，专属性强，精密度良好，准确度高，溶液稳定，可用于阿法替尼片的质量控制。

［1］史宁，韦林毅，吴久鸿.小分子抗肿瘤蛋白激酶抑制剂的研究进展［J］.中国药学杂志，2011，46(23):1784－1789.

［2］焦瑾.非小细胞肺癌治疗药—Gillotrif［J］.药学研究，2013，32(9):557 －558.

［3］Bruns A，Eichner S，Lehmann F，et al.Crystalline forms of afatinib di－maleate:WO，2013052157 A1［P］.2013 －4－11.

［4］Barta A.Process for drying of bibw2992，of its salts and solid pharmaceutical formulations comprising this active ingredient:US，20120107399 A1［P］.2012 －5 －3.