气相色谱—质谱联用选择离子监测方法定量分析低浓度胞内游离氨基酸的13C同位素丰度

李敏超+黄明志+刘玉伟等

摘要：胞内游离氨基酸具有周转快的特点，其13C同位素丰度能快速反映胞内代谢状态的变化。但胞内游离氨基酸的浓度很低，现有的基于气相色谱质谱联用全扫描模式的13C同位素丰度检测方法不能满足要求。本研究考察理论上检测精度更高的选择离子监测方法在胞内游离氨基酸13C同位素丰度分析中应用的可能性。首先在全扫描模式下分析了不同氨基酸的断裂规律，找出与每种氨基酸对应的特征碎片，建立起包含有16种胞内游离氨基酸的特征碎片库。利用此特征碎片库，在样品分析时只需检测特定m/z处的信号，从而实现选择离子监测，提高信号质量。对标准品的检测结果表明，与全扫描模式相比，本方法的信噪比、测量精度和准确性分别提高了17倍、2倍和3.8倍。在对辅酶Q10生产菌株样品的分析中，本方法成功检测出8种胞内游离氨基酸的同位素丰度。

关键词：选择离子监测； 13C同位素丰度； 气相色谱质谱联用； 游离氨基酸

1引言

13C代谢流分析技术（13CMFA）作为研究细胞生理代谢分布的重要工具，被广泛应用于各类细胞代谢、调控机制研究，其中13C同位素体丰度准确测定是进行13C代谢流计算的关键步骤[1～4]。13C同位素示踪技术是细胞利用13C同位素作为碳骨架，通过不同代谢途径，研究细胞代谢物的13C同位素分布差异。因此开展准确测定胞内游离小分子化合物13C同位素丰度分布对研究细胞生理代谢具有重要意义。

由于细胞内氨基酸等小分子物质本身浓度较低，基于全扫描模式的气相色谱质谱联用（GC检测方法不能满足测定游离氨基酸要求，因此，本研究考察了理论上检测精度更高的选择离子检测方法在准确在胞内游离氨基酸13C同位素丰度分析中的可能性。虽然GCMS测定水解蛋白质的氨基酸的13C同位素体已有报道[5～7]，但是直接用于检测胞内自由氨基酸13C同位素丰度的方法未见报道[8]。本研究首先在GCMS全扫描模式下，通过对氨基酸碎片分析，建立了氨基酸特征碎片库；并在此基础上采用选择离子模式（SIM）方法，测定自然标记下氨基酸13C同位素丰度；通过测定辅酶Q10生产菌株的实际样品中游离氨基酸13C同位素丰度，进行比较分析。

摘要：胞内游离氨基酸具有周转快的特点，其13C同位素丰度能快速反映胞内代谢状态的变化。但胞内游离氨基酸的浓度很低，现有的基于气相色谱质谱联用全扫描模式的13C同位素丰度检测方法不能满足要求。本研究考察理论上检测精度更高的选择离子监测方法在胞内游离氨基酸13C同位素丰度分析中应用的可能性。首先在全扫描模式下分析了不同氨基酸的断裂规律，找出与每种氨基酸对应的特征碎片，建立起包含有16种胞内游离氨基酸的特征碎片库。利用此特征碎片库，在样品分析时只需检测特定m/z处的信号，从而实现选择离子监测，提高信号质量。对标准品的检测结果表明，与全扫描模式相比，本方法的信噪比、测量精度和准确性分别提高了17倍、2倍和3.8倍。在对辅酶Q10生产菌株样品的分析中，本方法成功检测出8种胞内游离氨基酸的同位素丰度。

关键词：选择离子监测； 13C同位素丰度； 气相色谱质谱联用； 游离氨基酸

1引言

13C代谢流分析技术（13CMFA）作为研究细胞生理代谢分布的重要工具，被广泛应用于各类细胞代谢、调控机制研究，其中13C同位素体丰度准确测定是进行13C代谢流计算的关键步骤[1～4]。13C同位素示踪技术是细胞利用13C同位素作为碳骨架，通过不同代谢途径，研究细胞代谢物的13C同位素分布差异。因此开展准确测定胞内游离小分子化合物13C同位素丰度分布对研究细胞生理代谢具有重要意义。

由于细胞内氨基酸等小分子物质本身浓度较低，基于全扫描模式的气相色谱质谱联用（GC检测方法不能满足测定游离氨基酸要求，因此，本研究考察了理论上检测精度更高的选择离子检测方法在准确在胞内游离氨基酸13C同位素丰度分析中的可能性。虽然GCMS测定水解蛋白质的氨基酸的13C同位素体已有报道[5～7]，但是直接用于检测胞内自由氨基酸13C同位素丰度的方法未见报道[8]。本研究首先在GCMS全扫描模式下，通过对氨基酸碎片分析，建立了氨基酸特征碎片库；并在此基础上采用选择离子模式（SIM）方法，测定自然标记下氨基酸13C同位素丰度；通过测定辅酶Q10生产菌株的实际样品中游离氨基酸13C同位素丰度，进行比较分析。

摘要：胞内游离氨基酸具有周转快的特点，其13C同位素丰度能快速反映胞内代谢状态的变化。但胞内游离氨基酸的浓度很低，现有的基于气相色谱质谱联用全扫描模式的13C同位素丰度检测方法不能满足要求。本研究考察理论上检测精度更高的选择离子监测方法在胞内游离氨基酸13C同位素丰度分析中应用的可能性。首先在全扫描模式下分析了不同氨基酸的断裂规律，找出与每种氨基酸对应的特征碎片，建立起包含有16种胞内游离氨基酸的特征碎片库。利用此特征碎片库，在样品分析时只需检测特定m/z处的信号，从而实现选择离子监测，提高信号质量。对标准品的检测结果表明，与全扫描模式相比，本方法的信噪比、测量精度和准确性分别提高了17倍、2倍和3.8倍。在对辅酶Q10生产菌株样品的分析中，本方法成功检测出8种胞内游离氨基酸的同位素丰度。

关键词：选择离子监测； 13C同位素丰度； 气相色谱质谱联用； 游离氨基酸

1引言

13C代谢流分析技术（13CMFA）作为研究细胞生理代谢分布的重要工具，被广泛应用于各类细胞代谢、调控机制研究，其中13C同位素体丰度准确测定是进行13C代谢流计算的关键步骤[1～4]。13C同位素示踪技术是细胞利用13C同位素作为碳骨架，通过不同代谢途径，研究细胞代谢物的13C同位素分布差异。因此开展准确测定胞内游离小分子化合物13C同位素丰度分布对研究细胞生理代谢具有重要意义。

由于细胞内氨基酸等小分子物质本身浓度较低，基于全扫描模式的气相色谱质谱联用（GC检测方法不能满足测定游离氨基酸要求，因此，本研究考察了理论上检测精度更高的选择离子检测方法在准确在胞内游离氨基酸13C同位素丰度分析中的可能性。虽然GCMS测定水解蛋白质的氨基酸的13C同位素体已有报道[5～7]，但是直接用于检测胞内自由氨基酸13C同位素丰度的方法未见报道[8]。本研究首先在GCMS全扫描模式下，通过对氨基酸碎片分析，建立了氨基酸特征碎片库；并在此基础上采用选择离子模式（SIM）方法，测定自然标记下氨基酸13C同位素丰度；通过测定辅酶Q10生产菌株的实际样品中游离氨基酸13C同位素丰度，进行比较分析。