多重PCR检测猪链球菌种及主要致病血清型

王海丽+徐公义+赵德明

摘要：根据猪链球菌种特异性基因gdh及血清2、7、9型的特异性基因cps2J、cps7H、cps9H序列，分别设计4对引物，通过对单项PCR、多重PCR扩增条件和反应体系的优化，建立了快速检测猪链球菌种及主要致病血清型2、7、9型的四重PCR方法；并利用建立的多重PCR方法对鲁西区域致病性猪链球菌的流行情况进行了调查研究。

关键词：猪链球菌；菌种；致病血清型；多重PCR；检测方法

中图分类号：S852.61 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0212-02

猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种危害公共安全和现代养猪业的人兽共患病原体，有致从业人员感染的危险，猪链球菌病几乎危及所有规模化养猪国家^[1]。猪链球菌血清型众多，其中猪链球菌2型（SS2）对猪的致病性最强，流行亦最广；此外，猪链球菌 7型（SS7）和猪链球菌9型（SS9）等也是引起猪感染发病的重要血清型。谷氨酸脱氢酶（GDH）是细菌的一种十分重要的功能蛋白，其基因保守性高，点突变率极低，是病原体种属鉴定的重要诊断性抗原。Okwumabua等根据gdh基因设计猪链球菌种特异性引物，通过对306株链球菌的检测发现，目前发现的35个猪链球菌血清型中均检测出了gdh基因，而化脓链球菌、乳房链球菌、牛链球菌、链球菌兽疫亚种、马链球菌均未检测出gdh基因，因此，gdh通常作为猪链球菌的一种重要检测抗原^[2]。荚膜多糖（CPS）是区分猪链球菌血清型的重要依据之一^[3]。SS2 cps2J基因仅可以与2型和1/2血清型产生杂交，显示cps2J基因为SS2的特异性基因可以作为鉴定SS2 的依据。根据SS7型、SS9型基因与其他血清型的同源性比对，选择同源性低的阅读框基因作为检测基因。本试验以我国及山东等地SS血清型流行病学调查为参考，借鉴已发表的SS gdh基因作为种特异性引物，筛选2、7、9型cps特异性基因作为检测引物，在建立单项PCR的基础上优化反应体系和反应条件，建立特异性的多重PCR检测方法，可在诊断猪链球菌的同时进行主要致病血清型的分型。并利用本研究建立的多重PCR检测方法系统地对鲁西区域SS的流行状况进行了调查与分型研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及来源 标准菌株HA9801（SS2）、8074（SS7）、2083（SS9）基因组DNA由南京农业大学陆承平教授惠赠。49株分离株来源于鲁西各大养猪场^[4]，马链球菌兽医亚种、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌由聊城市畜禽疫病检测重点实验室、聊城市畜禽疫病诊疗工程技术研究中心保存。

1.1.2 主要试剂 Ex-Taq Mix、DNA marker和蛋白酶K等主要试剂均购自宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据国内外资料的报道^[5-8]，确定gdh基因保守区域为SS 种特异性靶基因，以cps基因为型特异性靶基因，设计血清2型、7型和9型检测引物（表1），由上海Sangon生物工程公司合成。

3 讨论

Arends 等对143个屠宰猪扁桃体开展了SS2 的检测研究，结果表明，荷兰SS2的带菌率在30 %以上^[9]。Breton 等对413 份屠宰猪扁桃体开展SS的分离，结果在加拿大猪场共分离到 180 株SS（分离率为43.6 %），SS2有29 株（占SS的16.1%）^[10]。Han 等对 406 个屠宰猪扁桃体进行SS的检测研究，结果从韩国猪场共分离出猪链球菌 55 株，临床9 型最多（16.4%）^[11]。可见，SS 在各国大猪场存在隐性感染的情况比较普遍。本研究结果显示，从各采样猪场不同生长阶段临床表观症状健康猪群中均检测出SS，表明鲁西地区临床表观症状健康的猪群中存在SS隐性带菌和潜在感染的威胁。

本研究结果对猪链球菌的表观症状健康猪群及患病猪群从分离率及血清型两方面反映出鲁西地区猪链球菌的流行状况。对鲁西地区分离到的49株SS PCR检测为阳性的样品进行了血清型的分型研究，鉴定出SS2、SS7和SS9 菌株的数量分别为 17株、2株和3株。SS2菌株的阳性率占SS总分离菌株的比例为34.7%，提示SS2在该地区猪群中的带菌比例相当高。鲁西地区分离到的49株SS，其相同血清型不同菌株间的毒力因子情况及不同血清型的致病性等都有待于进一步研究。

本研究建立了猪链球菌种及3种主要致病血清型2、7、9型的四重PCR方法，通过特异性检测和临床应用验证，表明该多重PCR方法的敏感性高、特异性强，可作为养殖一线开展猪链球菌快速诊断和流行病学调查的重要手段。

参考文献：

[1]Staats J J，Feder I，Okwumabua O，et al. Streptococcus suis：past and present[J]. Veterinary Research Communications，1997，21（6）：381-407.

[2]Okwumabua O，Persaud J S，Reddy P G. Cloning and characterization of the gene encoding the glutamate dehydrogenase of Streptococcus suis serotype 2[J]. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2001，8（2）：251-257.endprint

[3]Charland N，Kobisch M，Martineau-Doizé B，et al. Role of capsular sialic acid in virulence and resistance to phagocytosis of Streptococcus suis capsular type 2[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，1996，14（4）：195-203.

[4]王海丽，赵德明，葛长城，等. 猪链球菌的分离鉴定及病原特性研究[J]. 中国兽医杂志，2012，48（7）：36-39.

[5]Wisselink H J，Joosten J J，Smith H E. Multiplex PCR assays for simultaneous detection of six major serotypes and two virulence-associated phenotypes of Streptococcus suis in tonsillar specimens from pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（8）：2922-2929.

[6]Smith H E，Veenbergen V，van der Velde J，et al. The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1，2，and 9：development of rapid serotype-specific PCR assays[J]. Journal of Clinical Microbiology，1999，37（10）：3146-3152.

[7]Smith H E，van Bruijnsvoort L，Buijs H，et al. Rapid PCR test for Streptococcus suis serotype 7[J]. FEMS Microbiology Letters，1999，178（2）：265-270.

[8]Okwumabua O，OConnor M，Shull E. A polymerase chain reaction（PCR） assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[J]. FEMS Microbiology Letters，2003，218（1）：79-84.

[9]Arends J P，Hartwig N，Rudolphy M，et al. Carrier rate of Streptococcus suis capsular type 2 in palatine tonsils of slaughtered pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，1984，20（5）：945-947.

[10]Breton J，Mitchell W R，Rosendal S. Streptococcus suis in slaughter pigs and abattoir workers[J]. Canadian Journal of Veterinary Research，1986，50（3）：338-341.

[11]Han DU，Choi C，Ham H J，et al. Prevalence，capsular type and antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from slaughter pigs in Korea[J]. Canadian Journal of Veterinary Research，2001，65（3）：151-155.endprint

[3]Charland N，Kobisch M，Martineau-Doizé B，et al. Role of capsular sialic acid in virulence and resistance to phagocytosis of Streptococcus suis capsular type 2[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，1996，14（4）：195-203.

[4]王海丽，赵德明，葛长城，等. 猪链球菌的分离鉴定及病原特性研究[J]. 中国兽医杂志，2012，48（7）：36-39.

[5]Wisselink H J，Joosten J J，Smith H E. Multiplex PCR assays for simultaneous detection of six major serotypes and two virulence-associated phenotypes of Streptococcus suis in tonsillar specimens from pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（8）：2922-2929.

[6]Smith H E，Veenbergen V，van der Velde J，et al. The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1，2，and 9：development of rapid serotype-specific PCR assays[J]. Journal of Clinical Microbiology，1999，37（10）：3146-3152.

[7]Smith H E，van Bruijnsvoort L，Buijs H，et al. Rapid PCR test for Streptococcus suis serotype 7[J]. FEMS Microbiology Letters，1999，178（2）：265-270.

[8]Okwumabua O，OConnor M，Shull E. A polymerase chain reaction（PCR） assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[J]. FEMS Microbiology Letters，2003，218（1）：79-84.

[9]Arends J P，Hartwig N，Rudolphy M，et al. Carrier rate of Streptococcus suis capsular type 2 in palatine tonsils of slaughtered pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，1984，20（5）：945-947.

[10]Breton J，Mitchell W R，Rosendal S. Streptococcus suis in slaughter pigs and abattoir workers[J]. Canadian Journal of Veterinary Research，1986，50（3）：338-341.

[11]Han DU，Choi C，Ham H J，et al. Prevalence，capsular type and antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from slaughter pigs in Korea[J]. Canadian Journal of Veterinary Research，2001，65（3）：151-155.endprint

[3]Charland N，Kobisch M，Martineau-Doizé B，et al. Role of capsular sialic acid in virulence and resistance to phagocytosis of Streptococcus suis capsular type 2[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，1996，14（4）：195-203.

[4]王海丽，赵德明，葛长城，等. 猪链球菌的分离鉴定及病原特性研究[J]. 中国兽医杂志，2012，48（7）：36-39.

[5]Wisselink H J，Joosten J J，Smith H E. Multiplex PCR assays for simultaneous detection of six major serotypes and two virulence-associated phenotypes of Streptococcus suis in tonsillar specimens from pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（8）：2922-2929.

[6]Smith H E，Veenbergen V，van der Velde J，et al. The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1，2，and 9：development of rapid serotype-specific PCR assays[J]. Journal of Clinical Microbiology，1999，37（10）：3146-3152.

[7]Smith H E，van Bruijnsvoort L，Buijs H，et al. Rapid PCR test for Streptococcus suis serotype 7[J]. FEMS Microbiology Letters，1999，178（2）：265-270.

[8]Okwumabua O，OConnor M，Shull E. A polymerase chain reaction（PCR） assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[J]. FEMS Microbiology Letters，2003，218（1）：79-84.

[9]Arends J P，Hartwig N，Rudolphy M，et al. Carrier rate of Streptococcus suis capsular type 2 in palatine tonsils of slaughtered pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，1984，20（5）：945-947.

[10]Breton J，Mitchell W R，Rosendal S. Streptococcus suis in slaughter pigs and abattoir workers[J]. Canadian Journal of Veterinary Research，1986，50（3）：338-341.

[11]Han DU，Choi C，Ham H J，et al. Prevalence，capsular type and antimicrobial susceptibility of Streptococcus suis isolated from slaughter pigs in Korea[J]. Canadian Journal of Veterinary Research，2001，65（3）：151-155.endprint