有棱丝瓜与普通丝瓜种间杂种后代的ISSR分析
2014-10-23 20:05宋波陈龙正徐海郑涛袁希汉
江苏农业科学 2014年8期
宋波+陈龙正+徐海+郑涛+袁希汉
摘要：应用ISSR技术对有棱丝瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]与普通丝瓜[Luffa cylindrica （L.） Roem.]及其种间杂种F1、F2代的遗传差异性进行了研究。结果表明：供试材料基因组DNA间具有很高的多态性，双亲的遗传相似系数仅为0.395，F1的条带主要表现为双亲互补带型，F1、F2并没有明显向双亲任何一方遗传的倾向，F2的遗传变异较大。
关键词：有棱丝瓜；普通丝瓜；种间杂种；ISSR
中图分类号：S642.403.6 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0042-03
有棱丝瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]与普通丝瓜[Luffa cylindrical （L.） Roem.]是我国普遍种植的2个丝瓜栽培种。有棱丝瓜与普通丝瓜在花色、花期以及果实性状等农艺性状方面存在较大差异，同时二者具有许多互补的优良性状，如普通丝瓜的果皮碰擦后或果肉烹饪后均易变褐，而有棱丝瓜的果肉在烹饪后不变色，保持翠绿，口感清香。有棱丝瓜开花对日照长度要求严格，早熟性较差，产量不高，普通丝瓜一般早熟性好，产量高，可通过种间杂交，利用彼此的优良性状对二者进行有目的的改良[1-2]。 目前国内外关于丝瓜种间杂交研究集中在杂交技术、农艺性状等方面[1-4]，关于分子层面的研究未见报道。本研究对有棱丝瓜与普通丝瓜及其种间杂种F1、F2进行ISSR分析，从DNA分子水平分析亲本及杂交后代间的遗传差异性及相似性，旨在为揭示丝瓜种间杂交后代的遗传特性提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为有棱丝瓜（P1）、有棱丝瓜×普通丝瓜（F1）、普通丝瓜（P2）、20个F2单株，共23份材料。3叶期取幼苗嫩叶，用CTAB法提取基因组DNA。
1.2 ISSR分析
ISSR反应体系共20 μL。在灭菌的0.2 mL PCR薄壁管中依次加入下列组分：双蒸水 11.8 μL，10×Buffer溶液 2 μL，25 mmol/L MgCl2溶液 2 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L 20碱基随机引物 0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，20～40 ng 模板DNA 1 μL（以上各反应组分均购于上海生工生物工程技术服务有限公司）。稍加离心混匀后，在PTC-100 PCR仪中扩增。反应程序：预变性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55.8 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离1.5 h，电压为5 V/cm，0.5 μg/L溴化乙锭染色，用上海培青凝胶成像系统进行拍照分析。扩增片段的分子大小标记是 GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus。从70个引物中筛选出重复性好、适宜于各供试材料的6个引物（ISSR17、ISSR22、ISSR23、ISSR26、ISSR33、ISSR59）进行ISSR分析。
1.3 数据处理
每个样品的扩增条带按有或无记录，有带赋值为1，无带赋值为0，按Nei的方法[5]计算材料间的相似系数（genetic similarity）：
2.1.1 双亲和杂种F1的ISSR分析
由表1可知，6个引物在有棱丝瓜、普通丝瓜2个亲本中分别扩增出30、23条带，2个亲本的特异带分别为15、8条，各占50.0%、34.8%，因而很容易将有棱丝瓜与普通丝瓜区别开来。6个引物在F1中共扩增出35条带，其中与有棱丝瓜特异带相同的有12条，占34.3%；与普通丝瓜特异带相同的有8条，占22.9%。F1丢失了3条有棱丝瓜特异带，未丢失普通丝瓜特异带。从图1可看出，F1同时具有ISSR33-1500、ISSR33-1800两条双亲的互补条带，说明杂种F1的条带主要表现为双亲互补带型。
2.1.2 F2群体的ISSR分析
从表1可知，6个引物在F2群体中共扩增出22～34条带，F2-14仅扩增出22条带，其中丢失8条有棱丝瓜特异带、5条普通丝瓜特异带、3条父母本共有条带。F2-2扩增出34条带，仅丢失3条有棱丝瓜特异带，并全部继承普通丝瓜的特异条带，丢失1条父母本共有条带。F2与有棱丝瓜特异带相同的有5～12条，占扩增总带数的20.8%～40.0%。F2与普通丝瓜特异带相同的有3～8条，占扩增总带数的12%～26.9%。F2继承父母本共有条带有12～14条，说明在继承父母本共有条带上具有一定稳定性，但在F2群体中并未扩增出新的条带。
2.2 双亲与种间杂种后代的遗传相似系数比较
由表2可知，有棱丝瓜、普通丝瓜的遗传相似系数为0.395，表明双亲的遗传差异较大。有棱丝瓜与F1遗传相似系数为0.711，普通丝瓜与F1遗传相似系数为0.684，差异不显著。F2与有棱丝瓜的遗传相似系数为0.524～0.737，F2与普通丝瓜的遗传相似系数为0.553～0.763，说明F1、F2并没有明显向双亲任何一方遗传的倾向。F2株系间的遗传相似系数为0.500～0.895，表明F2的遗传变异较大。
本研究表明，有棱丝瓜与普通丝瓜之间的遗传相似系数较低，很好地解释了二者农艺性状差异较大的原因。这一结果与夏军辉对有棱丝瓜、普通丝瓜的RAPD分析结果[6]相一致。
本研究对丝瓜种间杂交后代进行了初步的ISSR分析，结果表明，杂种F1的条带主要表现为双亲互补带型，F2的条带全部来源于双亲，未出现新的条带，说明在继承双亲共有条带上具有较高稳定性。从理论上讲，经过减数分裂，F2应该会产生新的条带，这可能与本试验采用的引物较少有关。ISSR分子标记技术在丝瓜上具有较高的多态性，能很好地运用于丝瓜分子标记研究中，这为果肉褐变等分子标记开发研究奠定了基础。
参考文献：
[1]宋 波，苏小俊，陈 洁，等. 普通丝瓜与有棱丝瓜亚种间杂交的正反交效应分析[J]. 江苏农业科学，2008（5）：139-142.
[2]宋 波. 有棱丝瓜与普通丝瓜种间杂种后代的遗传分析[D]. 南京：南京农业大学，2008.
[3]袁希汉，苏小俊，高 军，等. 低温贮藏对丝瓜花粉活力和结实的影响[J]. 江苏农业科学，2008（2）：122-124.
[4]谢文军. 不同类型丝瓜杂种优势及性状遗传特性的研究[D]. 泰安：山东农业大学，2003.
[5]Nei M，Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1979，76（10）：5269-5273.
[6]夏军辉. 丝瓜种质资源遗传多样性研究[D]. 武汉：华中农业大学，2007.
摘要：应用ISSR技术对有棱丝瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]与普通丝瓜[Luffa cylindrica （L.） Roem.]及其种间杂种F1、F2代的遗传差异性进行了研究。结果表明：供试材料基因组DNA间具有很高的多态性，双亲的遗传相似系数仅为0.395，F1的条带主要表现为双亲互补带型，F1、F2并没有明显向双亲任何一方遗传的倾向，F2的遗传变异较大。
关键词：有棱丝瓜；普通丝瓜；种间杂种；ISSR
中图分类号：S642.403.6 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0042-03
有棱丝瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]与普通丝瓜[Luffa cylindrical （L.） Roem.]是我国普遍种植的2个丝瓜栽培种。有棱丝瓜与普通丝瓜在花色、花期以及果实性状等农艺性状方面存在较大差异，同时二者具有许多互补的优良性状，如普通丝瓜的果皮碰擦后或果肉烹饪后均易变褐，而有棱丝瓜的果肉在烹饪后不变色，保持翠绿，口感清香。有棱丝瓜开花对日照长度要求严格，早熟性较差，产量不高，普通丝瓜一般早熟性好，产量高，可通过种间杂交，利用彼此的优良性状对二者进行有目的的改良[1-2]。 目前国内外关于丝瓜种间杂交研究集中在杂交技术、农艺性状等方面[1-4]，关于分子层面的研究未见报道。本研究对有棱丝瓜与普通丝瓜及其种间杂种F1、F2进行ISSR分析，从DNA分子水平分析亲本及杂交后代间的遗传差异性及相似性，旨在为揭示丝瓜种间杂交后代的遗传特性提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为有棱丝瓜（P1）、有棱丝瓜×普通丝瓜（F1）、普通丝瓜（P2）、20个F2单株，共23份材料。3叶期取幼苗嫩叶，用CTAB法提取基因组DNA。
1.2 ISSR分析
ISSR反应体系共20 μL。在灭菌的0.2 mL PCR薄壁管中依次加入下列组分：双蒸水 11.8 μL，10×Buffer溶液 2 μL，25 mmol/L MgCl2溶液 2 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L 20碱基随机引物 0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，20～40 ng 模板DNA 1 μL（以上各反应组分均购于上海生工生物工程技术服务有限公司）。稍加离心混匀后，在PTC-100 PCR仪中扩增。反应程序：预变性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55.8 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离1.5 h，电压为5 V/cm，0.5 μg/L溴化乙锭染色，用上海培青凝胶成像系统进行拍照分析。扩增片段的分子大小标记是 GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus。从70个引物中筛选出重复性好、适宜于各供试材料的6个引物（ISSR17、ISSR22、ISSR23、ISSR26、ISSR33、ISSR59）进行ISSR分析。
1.3 数据处理
每个样品的扩增条带按有或无记录，有带赋值为1，无带赋值为0，按Nei的方法[5]计算材料间的相似系数（genetic similarity）：
2.1.1 双亲和杂种F1的ISSR分析
由表1可知，6个引物在有棱丝瓜、普通丝瓜2个亲本中分别扩增出30、23条带，2个亲本的特异带分别为15、8条，各占50.0%、34.8%，因而很容易将有棱丝瓜与普通丝瓜区别开来。6个引物在F1中共扩增出35条带，其中与有棱丝瓜特异带相同的有12条，占34.3%；与普通丝瓜特异带相同的有8条，占22.9%。F1丢失了3条有棱丝瓜特异带，未丢失普通丝瓜特异带。从图1可看出，F1同时具有ISSR33-1500、ISSR33-1800两条双亲的互补条带，说明杂种F1的条带主要表现为双亲互补带型。
2.1.2 F2群体的ISSR分析
从表1可知，6个引物在F2群体中共扩增出22～34条带，F2-14仅扩增出22条带，其中丢失8条有棱丝瓜特异带、5条普通丝瓜特异带、3条父母本共有条带。F2-2扩增出34条带，仅丢失3条有棱丝瓜特异带，并全部继承普通丝瓜的特异条带，丢失1条父母本共有条带。F2与有棱丝瓜特异带相同的有5～12条，占扩增总带数的20.8%～40.0%。F2与普通丝瓜特异带相同的有3～8条，占扩增总带数的12%～26.9%。F2继承父母本共有条带有12～14条，说明在继承父母本共有条带上具有一定稳定性，但在F2群体中并未扩增出新的条带。
2.2 双亲与种间杂种后代的遗传相似系数比较
由表2可知，有棱丝瓜、普通丝瓜的遗传相似系数为0.395，表明双亲的遗传差异较大。有棱丝瓜与F1遗传相似系数为0.711，普通丝瓜与F1遗传相似系数为0.684，差异不显著。F2与有棱丝瓜的遗传相似系数为0.524～0.737，F2与普通丝瓜的遗传相似系数为0.553～0.763，说明F1、F2并没有明显向双亲任何一方遗传的倾向。F2株系间的遗传相似系数为0.500～0.895，表明F2的遗传变异较大。
本研究表明，有棱丝瓜与普通丝瓜之间的遗传相似系数较低，很好地解释了二者农艺性状差异较大的原因。这一结果与夏军辉对有棱丝瓜、普通丝瓜的RAPD分析结果[6]相一致。
本研究对丝瓜种间杂交后代进行了初步的ISSR分析，结果表明，杂种F1的条带主要表现为双亲互补带型，F2的条带全部来源于双亲，未出现新的条带，说明在继承双亲共有条带上具有较高稳定性。从理论上讲，经过减数分裂，F2应该会产生新的条带，这可能与本试验采用的引物较少有关。ISSR分子标记技术在丝瓜上具有较高的多态性，能很好地运用于丝瓜分子标记研究中，这为果肉褐变等分子标记开发研究奠定了基础。
参考文献：
[1]宋 波，苏小俊，陈 洁，等. 普通丝瓜与有棱丝瓜亚种间杂交的正反交效应分析[J]. 江苏农业科学，2008（5）：139-142.
[2]宋 波. 有棱丝瓜与普通丝瓜种间杂种后代的遗传分析[D]. 南京：南京农业大学，2008.
[3]袁希汉，苏小俊，高 军，等. 低温贮藏对丝瓜花粉活力和结实的影响[J]. 江苏农业科学，2008（2）：122-124.
[4]谢文军. 不同类型丝瓜杂种优势及性状遗传特性的研究[D]. 泰安：山东农业大学，2003.
[5]Nei M，Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1979，76（10）：5269-5273.
[6]夏军辉. 丝瓜种质资源遗传多样性研究[D]. 武汉：华中农业大学，2007.
摘要：应用ISSR技术对有棱丝瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]与普通丝瓜[Luffa cylindrica （L.） Roem.]及其种间杂种F1、F2代的遗传差异性进行了研究。结果表明：供试材料基因组DNA间具有很高的多态性，双亲的遗传相似系数仅为0.395，F1的条带主要表现为双亲互补带型，F1、F2并没有明显向双亲任何一方遗传的倾向，F2的遗传变异较大。
关键词：有棱丝瓜；普通丝瓜；种间杂种；ISSR
中图分类号：S642.403.6 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0042-03
有棱丝瓜[Luffa acutangula （L.） Roxb.]与普通丝瓜[Luffa cylindrical （L.） Roem.]是我国普遍种植的2个丝瓜栽培种。有棱丝瓜与普通丝瓜在花色、花期以及果实性状等农艺性状方面存在较大差异，同时二者具有许多互补的优良性状，如普通丝瓜的果皮碰擦后或果肉烹饪后均易变褐，而有棱丝瓜的果肉在烹饪后不变色，保持翠绿，口感清香。有棱丝瓜开花对日照长度要求严格，早熟性较差，产量不高，普通丝瓜一般早熟性好，产量高，可通过种间杂交，利用彼此的优良性状对二者进行有目的的改良[1-2]。 目前国内外关于丝瓜种间杂交研究集中在杂交技术、农艺性状等方面[1-4]，关于分子层面的研究未见报道。本研究对有棱丝瓜与普通丝瓜及其种间杂种F1、F2进行ISSR分析，从DNA分子水平分析亲本及杂交后代间的遗传差异性及相似性，旨在为揭示丝瓜种间杂交后代的遗传特性提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料为有棱丝瓜（P1）、有棱丝瓜×普通丝瓜（F1）、普通丝瓜（P2）、20个F2单株，共23份材料。3叶期取幼苗嫩叶，用CTAB法提取基因组DNA。
1.2 ISSR分析
ISSR反应体系共20 μL。在灭菌的0.2 mL PCR薄壁管中依次加入下列组分：双蒸水 11.8 μL，10×Buffer溶液 2 μL，25 mmol/L MgCl2溶液 2 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L 20碱基随机引物 0.5 μL，TaqDNA聚合酶1 U，20～40 ng 模板DNA 1 μL（以上各反应组分均购于上海生工生物工程技术服务有限公司）。稍加离心混匀后，在PTC-100 PCR仪中扩增。反应程序：预变性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55.8 ℃，45 s，72 ℃，2 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分离1.5 h，电压为5 V/cm，0.5 μg/L溴化乙锭染色，用上海培青凝胶成像系统进行拍照分析。扩增片段的分子大小标记是 GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus。从70个引物中筛选出重复性好、适宜于各供试材料的6个引物（ISSR17、ISSR22、ISSR23、ISSR26、ISSR33、ISSR59）进行ISSR分析。
1.3 数据处理
每个样品的扩增条带按有或无记录，有带赋值为1，无带赋值为0，按Nei的方法[5]计算材料间的相似系数（genetic similarity）：
2.1.1 双亲和杂种F1的ISSR分析
由表1可知，6个引物在有棱丝瓜、普通丝瓜2个亲本中分别扩增出30、23条带，2个亲本的特异带分别为15、8条，各占50.0%、34.8%，因而很容易将有棱丝瓜与普通丝瓜区别开来。6个引物在F1中共扩增出35条带，其中与有棱丝瓜特异带相同的有12条，占34.3%；与普通丝瓜特异带相同的有8条，占22.9%。F1丢失了3条有棱丝瓜特异带，未丢失普通丝瓜特异带。从图1可看出，F1同时具有ISSR33-1500、ISSR33-1800两条双亲的互补条带，说明杂种F1的条带主要表现为双亲互补带型。
2.1.2 F2群体的ISSR分析
从表1可知，6个引物在F2群体中共扩增出22～34条带，F2-14仅扩增出22条带，其中丢失8条有棱丝瓜特异带、5条普通丝瓜特异带、3条父母本共有条带。F2-2扩增出34条带，仅丢失3条有棱丝瓜特异带，并全部继承普通丝瓜的特异条带，丢失1条父母本共有条带。F2与有棱丝瓜特异带相同的有5～12条，占扩增总带数的20.8%～40.0%。F2与普通丝瓜特异带相同的有3～8条，占扩增总带数的12%～26.9%。F2继承父母本共有条带有12～14条，说明在继承父母本共有条带上具有一定稳定性，但在F2群体中并未扩增出新的条带。
2.2 双亲与种间杂种后代的遗传相似系数比较
由表2可知，有棱丝瓜、普通丝瓜的遗传相似系数为0.395，表明双亲的遗传差异较大。有棱丝瓜与F1遗传相似系数为0.711，普通丝瓜与F1遗传相似系数为0.684，差异不显著。F2与有棱丝瓜的遗传相似系数为0.524～0.737，F2与普通丝瓜的遗传相似系数为0.553～0.763，说明F1、F2并没有明显向双亲任何一方遗传的倾向。F2株系间的遗传相似系数为0.500～0.895，表明F2的遗传变异较大。
本研究表明，有棱丝瓜与普通丝瓜之间的遗传相似系数较低，很好地解释了二者农艺性状差异较大的原因。这一结果与夏军辉对有棱丝瓜、普通丝瓜的RAPD分析结果[6]相一致。
本研究对丝瓜种间杂交后代进行了初步的ISSR分析，结果表明，杂种F1的条带主要表现为双亲互补带型，F2的条带全部来源于双亲，未出现新的条带，说明在继承双亲共有条带上具有较高稳定性。从理论上讲，经过减数分裂，F2应该会产生新的条带，这可能与本试验采用的引物较少有关。ISSR分子标记技术在丝瓜上具有较高的多态性，能很好地运用于丝瓜分子标记研究中，这为果肉褐变等分子标记开发研究奠定了基础。
参考文献：
[1]宋 波，苏小俊，陈 洁，等. 普通丝瓜与有棱丝瓜亚种间杂交的正反交效应分析[J]. 江苏农业科学，2008（5）：139-142.
[2]宋 波. 有棱丝瓜与普通丝瓜种间杂种后代的遗传分析[D]. 南京：南京农业大学，2008.
[3]袁希汉，苏小俊，高 军，等. 低温贮藏对丝瓜花粉活力和结实的影响[J]. 江苏农业科学，2008（2）：122-124.
[4]谢文军. 不同类型丝瓜杂种优势及性状遗传特性的研究[D]. 泰安：山东农业大学，2003.
[5]Nei M，Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1979，76（10）：5269-5273.
[6]夏军辉. 丝瓜种质资源遗传多样性研究[D]. 武汉：华中农业大学，2007.
