红平菇HP1漆酶基因及启动子克隆和序列分析

郑苗苗+邵淑丽+张令昻+焦战战

摘要：以优化后的漆酶培养基为基础，将RT-PCR、RACE技术相结合，从红平菇菌株中获得漆酶基因cDNA全长及Genomic DNA全长序列，Genomic DNA大小为2 344 bp。通过对漆酶基因cDNA全长和Genomic DNA全长序列的比较，结果显示该基因包含13个外显子和12个内含子。基因cDNA全长为1 746 bp，其中包含1个完整的ORF，长度为1 590 bp，编码529个氨基酸。序列在氨基酸水平上与桃红侧耳Pleurotus salmoneostramineus的氨基酸序列具有较高的同源性，相似性达97%，与齿耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性达到72%。通过SEFA-PCR的方法，扩增得到漆酶基因起始密码子上游长1 126 bp的启动子序列。分析表明，该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box、AP2等基本的转录起始元件外，还存在多个潜在的顺式作用元件序列位点，包括4个MRE元件、2个CreA热击元件、2个STRE元件、1个NIT2元件、1个HSEs元件、1个XRE异生物质反应元件、4个氮因子结合位点等。不同外源诱导物可以调节红平菇HP1漆酶基因的表达。

关键词：红平菇；漆酶基因；启动子克隆；转录调控

中图分类号：S646.1+40.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0021-05

漆酶（laccase）是一种含铜的多酚氧化酶，属于氧化酶的蓝铜家族。漆酶含有4个铜原子，分别位于3个不同结合位点，并且高度保守^[1]。1883年吉田在漆树中发现漆酶，1893年Laborde在真菌中发现漆酶。目前证实漆酶普遍存在于细菌、真菌、植物、昆虫中^[2]。其中真菌中的白腐菌是最重要的漆酶生产菌。近年来，漆酶是医学、化学、生物学、环境科学等领域的研究热点^[3]。目前对漆酶生理生化的研究比较明确，已经研究到分子水平并深入基因工程阶段，已经克隆许多漆酶基因cDNA及Genomic DNA全长序列，并对其序列进行了核苷酸分析^[4]。真菌漆酶存在很多同工酶基因，由于菌株生长环境和生理状态不同，其表达量也有所不同^[5]。研究表明，真菌漆酶的分泌受金属离子、营养元素及芳香化合物影响，这些因素是在转录水平诱导漆酶上调表达^[6]。由起始密码子上游的启动子及相应顺式作用元件的作用，转录水平的表达量增加。因此，研究真菌漆酶基因上游的启动子结构及功能对于提高漆酶蛋白的表达产量非常重要。本研究从红平菇HP1中提取总DNA，利用SEFA-PCR技术克隆了漆酶基因的启动子序列并对其结构进行分析，以期为进一步了解漆酶基因的表达调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

红平菇HP1 Pleurotus djamor采集于凉水国家自然保护区，由齐齐哈尔大学微生物实验室保存。DNAquick_快捷型植物基因组DNA提取系统、DNAquick Plant System均购自TIANGEN公司；SMART RACE cDNA扩增试剂盒（Clontech）；E.Z.N.A真菌RNA提取试剂盒（OMEGA）；E.Z.N.A凝胶回收试剂盒（OMEGA）；两步法RT-PCR试剂盒、Genome Walking Kit试剂盒、3′RACE试剂盒均购自TaKaRa公司；E.coli JM109感受态细胞购自TaKaRa公司；pMD20-T Vector、LA Taq DNA聚合酶（Promega）；其余试剂为进口或国产分析纯。

1.2 基因组DNA和总RNA的提取

以陈军等报道的优化后的漆酶培养基^[7]培养红平菇HP1。提取红平菇HP1基因组DNA和总RNA，用核酸检测仪测定产物纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检验完整性。

1.3 cDNA核心片段克隆

合成cDNA第1链参照两步法RT-PCR试剂盒使用说明进行。在GenBank中选取20条漆酶基因全长的氨基酸序列，根据比对结果查找出同源序列保守区，从而设计1对简并引物（表1），PCR反应体系30 μL，含10×PCR buffer 3 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1μL，5 U/μL TaKaRa Ex TaqTM HS 0.5 μL，引物Lcc1-RT1和Lcc1-RT2各 1 μL，cDNA 2 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃延伸8 min。取5 μL扩增产物用 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定（以下检测方法同）。

1.4 漆酶cDNA3′/5′末端的RACE-PCR扩增

参照3′RACE试剂盒和SMART RACE cDNA扩增试剂盒使用说明合成cDNA，根据漆酶cDNA基因片段序列，设计3′/5′RACE特异性引物，获得其3′/5′末端序列（表1），cDNA 3′末端套式PCR反应体系25 μL，第1次PCR反应含10×LA PCR buffer Ⅱ（Mg2+Free）2 μL，25 mmol/L MgCl2 1 μL，1×cDNA Dilution buffer Ⅱ 1 μL，10 μmol/L 3′RACE Outer Primer 1 μL，5 U/μL TaKaRa LA Taq

15 min。第2次PCR反应含10×LA PCR buffer Ⅱ（Mg2+Free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，10 μmol/L Gene Specific Inner Primer 1 μL，10 μmol/L 3′ RACE Inner Primer 1 μL，5 U/μL TaKaRa LA Taq 0.25 μL，第1次 PCR产物 0.5 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 15 min。cDNA5′末端套式PCR反应体系25 μL，10×Advantage2 PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，50×Advantage2 polymerase Mix 0.5 μL，5′ RACE-Ready cDNA 1.5 μL，10 μmol/L GSP1 0.5 μL，UPM（10×）2.5 μL。反应条件同3′ RACE。

1.5 漆酶cDNA全长及漆酶Genomic DNA全长的扩增

根据cDNA 3′/5′末端核苷酸序列结果，分别在其3′和5′末端设计特异性引物，用于扩增漆酶cDNA全长序列（表1）。同时以基因组DNA为模板，扩增漆酶基因组全长。cDNA全长PCR反应体系50 μL，含5×Prime STARTM buffer（Mg2+ plus） 10 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，2.5 U/μL Prime STARTM HS DNA Polymerase 0.5 μL，引物Lcc1-S1和 Lcc1-S2 各1 μL，反转录cDNA 5 μL。Genomic DNA全长PCR反应体系及反应条件同“1.3”节。

1.6 SEFA-PCR法克隆漆酶基因的启动子序列

根据已获得的漆酶Genomic DNA全长序列，设计5′端启动子特异性引物，分别为Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3，以基因组DNA为模板进行3轮PCR扩增，获得漆酶基因5′端启动子序列（表1）。

1.7 漆酶基因结构及启动子结构分析

将上述得到的漆酶全长基因cDNA和基因组全长以及5′端启动子序列经过胶回收试剂盒纯化后，进行T载体克隆，并送交北京英俊公司测序。运用生物信息学技术对获得的漆酶全长基因cDNA和基因组以及5′端启动子序列进行同源性比较及结构特点分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA检测

提取红平菇菌丝体总RNA后，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，28S rRNA、18S rRNA条带较清晰，且2条带比值接近于2 ∶1，证明总RNA较完整。经核酸检测仪检测，280/260、260/230分别为2.01、2.57，说明纯度较高。所提取总RNA可以用于后续试验（图1）。

2.2 红平菇HP1漆酶基因cDNA全长的克隆与序列分析

根据真菌漆酶高度保守Cu-bind结构域Ⅰ、Ⅳ的氨基酸序列，设计1对简并引物并扩增漆酶基因cDNA片段，得到1条约1 000 bp大小条带，将其进行大肠杆菌转化并测序，测序结果为1 021 bp，进行Blastx比对后证明是漆酶基因（图2）。根据已知的漆酶cDNA片段，设计3′端特异性的正向引物：3′RACE GSP （outer）和3′RACE NGSP （inner），以反转录的 cDNA 第1条链为模板，扩增3′ cDNA末端，获得约750 bp大小条带，进行测序后漆酶基因片段为742 bp，其3′末端有典型的PolyA尾巴，并且具有加尾信号（AATAAA）（图3、图4）。根据已知的漆酶cDNA片段设计5′端特异性反向互补引物：5′RACE GSP，以反转录液为模板，扩增5′ cDNA末端，获得约 750 bp 大小条带，进行测序后基因片段为732 bp，5′端有一典型UTR区（1～66 bp），编码区长度为666 bp，该基因片段与RT-PCR扩增的基因片段有重复区域，进行Blastx比对后证明是漆酶基因（图5）。

将RT-PCR获得的漆酶基因片段与3′/5′RACE获得的漆酶基因片段进行剪切拼接，得到cDNA基因全长为 1 746 bp，命名为Pd-lac1。漆酶具有真核生物基因的一般特征，在其5′端有1个UTR区，长度为66 bp；3′端具有PolyA尾巴和加尾信号（AATAAA）。通过NCBI的ORF Finder检测到1条长1 590 bp的完整开放式阅读框，其编码529个氨基酸，预测蛋白分子质量为55.52 ku，限制性酶切位点有78个，等电点pI约为4.72。应用RPS-Blast软件进行Cu-bind结构域分析表明，该蛋白有3个Cu-bind结构域，即pfam07732、pfam07731、pfam00394，其中pfam07732、pfam07731是多铜氧化酶中与次级代谢物运输、分解代谢和生物合成相关的结构域；pfam00394是Cu离子保守结构域。利用SignalP V2.0软件分析位于氨基酸序列N端具有真核基因的信号肽序列（1～19aa），剪切位点为AHA-AI。利用Scanprosite软件分析得出，在漆酶基因编码的氨基酸序列中含有3个N-糖基化位点（N-X-S/T），天冬酰胺残基分别位于序列中的第216、311、444处，它们是潜在的糖基化位点。将漆酶编码的氨基酸序列与已知的蛋白序列进行Blastp比对后发现，它与桃红侧耳Pleurotus salmoneostramineus的氨基酸序列具有较高的同源性，相似性达97%，与齿耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性达到72%。

2.3 漆酶Genomic DNA全长的克隆与结构分析

根据漆酶全长cDNA序列设计1对特异性全长引物，以提取总DNA为模板通过全长PCR扩增得到该漆酶Genomic DNA的全长序列，全长为2 258 bp，命名为Pd-lac1（图6）。

利用NCBI网站的Align Sequences Nucleotide BLAST对漆酶基因cDNA全长和基因组DNA全长序列进行分析，在所克隆的漆酶基因组DNA中包含13个外显子和12个内含子。内含子长度分别为56、48、53、51、55、66、51、51、58、68、51、56 bp，是典型的真菌内含子长度（49～85 bp）。每个内含子剪切位点序列为5′GT…AG-3′（图7）。

2.4 漆酶基因启动子的获得与转录调控元件分析

根据漆酶Genomic DNA全长序列信息，参照Liu的方法^[8]，靠近5′端设计3条反向引物Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3，以红平菇HP1基因组DNA为模板对该基因上游片段进行hiTAIL_PCR扩增。3轮反应后，引物Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3获得了较长的PCR产物（图8）。对第3轮PCR中的Lcc1-SP3、AP3引物产物进行回收测序，获得了总长度1 500 bp的序列信息，分析发现该序列包括漆酶基因5′末端及其上游。

利用Biological Services网站的Sequence Analysis对克隆得到的Pd-lac启动子序列进行分析。在Pd-lac启动子序列中，具有真核生物典型的启动子基本转录调控元件，Pd-lac的启动子序列中存在许多潜在的外源诱导物响应结合元件，1个CAAT框，位于第-105位；2个热击元件（CreA）（SYGGRG），分别位于-78、-396位；2个AP2元件，分别位于第-164、-566位；1个潜在的热击响应元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2个潜在的压力响应元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分别位于第-157、-866位；4个金属应答元件（MRE）（TGCRCNG），分别位于第-381、-466、-803、-928位；1个异生物质反应元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4个氮因子结合位点（GATA）或其互补序列（TATC），分别位于第-299、-356、-708、-983位；1个NIT2元件，位于第-418位；1个热击元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（图7）。

2.5 红平菇HP1漆酶基因的系统进化分析

从150个菌株中选取34个相关性菌株，与Pleurotus djamor按照UPGMA聚类法进行系统进化树分析。从图9可以看出，35个菌株分为3大类群，其中1类是16个菌株聚成第1个大类群，为多孔菌（Polyporales）；2类是16个菌株聚成第2个大类群，为伞菌（Agaricales）；3类是3个菌株聚成第3个大类群，为子囊菌（Ascomycota）。红平菇漆酶cDNA基因属于伞菌，与Pleurotus salmoneostramineus遗传距离最近，同源性为97%。从系统进化树可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遗传距离也具有差异，如Lenzites gibbosa等。

3 结论与讨论

红平菇漆酶5′端调控区域具有真核生物典型的启动子转录元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box还具有金属离子效应位点（MRE），MRE对金属硫蛋白基因响应重金属离子的诱导起着至关重要的作用。另外，还分布有2个潜在的压力响应元件（STRE）和1个潜在的热激响应元件（HSEs），HSEs通过感受外界热刺激，进而激活金属硫蛋白基因的转录，因而STRE、HSEs可能会共同响应高浓度Cu2+的压力而激活红平菇漆酶基因的转录^[2]。红平菇漆酶5′启动子的克隆，为漆酶表达调控机制的研究奠定了基础。红平菇漆酶5′启动子属于可诱导型启动子，这为构建红平菇诱导型表达载体提供了理论基础。

1个漆酶cDNA全长基因和基因组DNA全长序列，这对于今后研究漆酶基因的同源表达、异源表达及蛋白质的纯化奠定了基础。利用SEFA-PCR技术在红平菇菌株中克隆1个漆酶5′启动子序列，这对于今后研究红平菇漆酶的表达调控具有十分重要的意义。

参考文献：

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[7]陈 军，高大文，池玉杰，等. 偏肿拟栓菌 Pseudotrametes gibbosa 产漆酶的条件优化[J]. 菌物学报，2008，27（6）：940-946.

[8]Liu Y G，Chen Y L. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences[J]. Biotechniques，2007，43（5）：649-650.

[9]Treger J M，Magee T R，Mcentee K. Functional analysis of the stress response element and its role in the multistress response of Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，243（1）：13-19.

[10]Strauss J，Horvath H K，Abdallah B M，et al. The function of CreA，the carbon catabolite repressor of Aspergillus nidulans，is regulated at the transcriptiosl and post-transcriptional level[J]. Molecular Microbiology，1999，32（1）：169-178.

利用Biological Services网站的Sequence Analysis对克隆得到的Pd-lac启动子序列进行分析。在Pd-lac启动子序列中，具有真核生物典型的启动子基本转录调控元件，Pd-lac的启动子序列中存在许多潜在的外源诱导物响应结合元件，1个CAAT框，位于第-105位；2个热击元件（CreA）（SYGGRG），分别位于-78、-396位；2个AP2元件，分别位于第-164、-566位；1个潜在的热击响应元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2个潜在的压力响应元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分别位于第-157、-866位；4个金属应答元件（MRE）（TGCRCNG），分别位于第-381、-466、-803、-928位；1个异生物质反应元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4个氮因子结合位点（GATA）或其互补序列（TATC），分别位于第-299、-356、-708、-983位；1个NIT2元件，位于第-418位；1个热击元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（图7）。

2.5 红平菇HP1漆酶基因的系统进化分析

从150个菌株中选取34个相关性菌株，与Pleurotus djamor按照UPGMA聚类法进行系统进化树分析。从图9可以看出，35个菌株分为3大类群，其中1类是16个菌株聚成第1个大类群，为多孔菌（Polyporales）；2类是16个菌株聚成第2个大类群，为伞菌（Agaricales）；3类是3个菌株聚成第3个大类群，为子囊菌（Ascomycota）。红平菇漆酶cDNA基因属于伞菌，与Pleurotus salmoneostramineus遗传距离最近，同源性为97%。从系统进化树可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遗传距离也具有差异，如Lenzites gibbosa等。

3 结论与讨论

红平菇漆酶5′端调控区域具有真核生物典型的启动子转录元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box还具有金属离子效应位点（MRE），MRE对金属硫蛋白基因响应重金属离子的诱导起着至关重要的作用。另外，还分布有2个潜在的压力响应元件（STRE）和1个潜在的热激响应元件（HSEs），HSEs通过感受外界热刺激，进而激活金属硫蛋白基因的转录，因而STRE、HSEs可能会共同响应高浓度Cu2+的压力而激活红平菇漆酶基因的转录^[2]。红平菇漆酶5′启动子的克隆，为漆酶表达调控机制的研究奠定了基础。红平菇漆酶5′启动子属于可诱导型启动子，这为构建红平菇诱导型表达载体提供了理论基础。

1个漆酶cDNA全长基因和基因组DNA全长序列，这对于今后研究漆酶基因的同源表达、异源表达及蛋白质的纯化奠定了基础。利用SEFA-PCR技术在红平菇菌株中克隆1个漆酶5′启动子序列，这对于今后研究红平菇漆酶的表达调控具有十分重要的意义。

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[10]Strauss J，Horvath H K，Abdallah B M，et al. The function of CreA，the carbon catabolite repressor of Aspergillus nidulans，is regulated at the transcriptiosl and post-transcriptional level[J]. Molecular Microbiology，1999，32（1）：169-178.

利用Biological Services网站的Sequence Analysis对克隆得到的Pd-lac启动子序列进行分析。在Pd-lac启动子序列中，具有真核生物典型的启动子基本转录调控元件，Pd-lac的启动子序列中存在许多潜在的外源诱导物响应结合元件，1个CAAT框，位于第-105位；2个热击元件（CreA）（SYGGRG），分别位于-78、-396位；2个AP2元件，分别位于第-164、-566位；1个潜在的热击响应元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2个潜在的压力响应元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分别位于第-157、-866位；4个金属应答元件（MRE）（TGCRCNG），分别位于第-381、-466、-803、-928位；1个异生物质反应元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4个氮因子结合位点（GATA）或其互补序列（TATC），分别位于第-299、-356、-708、-983位；1个NIT2元件，位于第-418位；1个热击元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（图7）。

2.5 红平菇HP1漆酶基因的系统进化分析

从150个菌株中选取34个相关性菌株，与Pleurotus djamor按照UPGMA聚类法进行系统进化树分析。从图9可以看出，35个菌株分为3大类群，其中1类是16个菌株聚成第1个大类群，为多孔菌（Polyporales）；2类是16个菌株聚成第2个大类群，为伞菌（Agaricales）；3类是3个菌株聚成第3个大类群，为子囊菌（Ascomycota）。红平菇漆酶cDNA基因属于伞菌，与Pleurotus salmoneostramineus遗传距离最近，同源性为97%。从系统进化树可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遗传距离也具有差异，如Lenzites gibbosa等。

3 结论与讨论

红平菇漆酶5′端调控区域具有真核生物典型的启动子转录元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box还具有金属离子效应位点（MRE），MRE对金属硫蛋白基因响应重金属离子的诱导起着至关重要的作用。另外，还分布有2个潜在的压力响应元件（STRE）和1个潜在的热激响应元件（HSEs），HSEs通过感受外界热刺激，进而激活金属硫蛋白基因的转录，因而STRE、HSEs可能会共同响应高浓度Cu2+的压力而激活红平菇漆酶基因的转录^[2]。红平菇漆酶5′启动子的克隆，为漆酶表达调控机制的研究奠定了基础。红平菇漆酶5′启动子属于可诱导型启动子，这为构建红平菇诱导型表达载体提供了理论基础。

1个漆酶cDNA全长基因和基因组DNA全长序列，这对于今后研究漆酶基因的同源表达、异源表达及蛋白质的纯化奠定了基础。利用SEFA-PCR技术在红平菇菌株中克隆1个漆酶5′启动子序列，这对于今后研究红平菇漆酶的表达调控具有十分重要的意义。

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[9]Treger J M，Magee T R，Mcentee K. Functional analysis of the stress response element and its role in the multistress response of Saccharomyces cerevisiae[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1998，243（1）：13-19.

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