ELISA法检测花生油中黄曲霉毒素B1前处理方法的改进研究

付珑

摘要：目的：对国标GB/T 5009.22-2003中第二法ELISA法测定花生油中黄曲霉毒素B1的样品前处理进行改良。方法：通过分别考察不同浓度的甲醇提取溶剂，分液漏斗萃取的不同振荡力度及频率，pH的调节对免疫反应的影响等。结果：提出了样品处理的最佳组合：使用60%甲醇提取液，分液漏斗萃取最优转速250rpm，振荡时间15min，样品提取物pH调节为6-8。新改进方法下样品加标回收率在80～110%之间。提高了ELISA法检测花生油黄曲霉毒素B1的效率和准确度。

关键词：花生油 黄曲霉毒素B1 ELISA 前处理方法 改进

中图分类号：R155.5+8 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）16-0025-02

Abstract：objective：The ELISA detection method of Aflatoxin B1 in peanut oil should be optimized in national standard（GB/T 5009.22--2003）.Method：Respectively inspect different concentration of methanol extraction solvent，and extract different oscillation intensity and frequency with separating funnel，as well as study the effect of pH adjustment on the immune response.Result：Abstract the best combination of sample processing by using 60% methanol extract，the optional way of separating funnel extraction speech is 250rpm，the oscillation time is 15min，pH adjustment of sample extracts is 6—8.The sample standard addition recovery rate is between 80% and 110% with the new improved method.It helps improve the ELISAs efficiency and accuracy of detecting Aflatoxin B1 in peanut oil.

Key Words：peanut oil；aflatoxin B1；ELISA；pretreatment method；improvement

黃曲霉毒素（Alfatoxin，AFT）主要是黄曲霉和寄生曲菌产生的次生代谢产物，具一类化学结构类似的化合物，二氢呋喃香豆素的衍生物。主要包括B1、B2、G1、G2、M1、M2等六种成分[1]。是一种剧毒物质。1993年被卫生组织的癌症研究机构定为1类致癌物，其中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强[2]。植物油中的黄曲霉毒素B1是食品中真菌毒素残留的日常检测指标[3]。我国规定AFB1在花生油的最大限量标准为20μg/kg。目前常见的方法主要有薄层层析法（TLC）、液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附法（ELISA）[4]。TLC和HPLC法存在样品处理复杂，分析时间长，设备昂贵等缺点，ELISA法因灵敏、简便、快速、成本低廉，适合大批量检测而被广泛应用。AFB1检测的准确度与样品是否完全提取有关。如何提高样品的提取率，本文从样品提取溶剂比例、萃取的振荡力度及频率、pH的控制等因素进行改进研究，减少人工操作，提高检测的准确度。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

酶标仪（上海三科仪器有限公司）、分液漏斗振荡器（日本ATAGO）、ELISH快速测试盒（山西德丰信成生物科技有限公司）、恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、分析天平（德国SARTOIUS）、50～300μL八道移液器（Thermo Scientific）。甲醇（天津永大化学试剂有限公司）、石油醚（广州化学试剂厂）均为分析纯。

1.2 样品采集

实验用10批次花生油，购自市场粮油销售点。

1.3 样品提取

（1）国标方法。参照国标（GB/T 5009.22-2003）中第二法的样品处理方法，制成样品提取物。

（2）对国标方法加以改进。准确称取5g花生油于25mL烧杯中，用20mL石油醚分次将试样转移至125mL分液漏斗中，准确加入25mL提取液，加塞，振摇10秒后排气，再加塞，防止液漏，移到一定转速的分液漏斗振荡器振荡一定时间，静置分层，放出下层提取液，此液即为样品提取物。

1.4 ELISA检测步骤

（1）从冰箱中取出黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒，平衡至室温。把浓缩洗涤液按3：57比例稀释，配成洗涤工作液，并清洗抗体板条2次，拍干后备用。

（2）选择数孔分别加入50μL黄曲霉毒素B1系列标准溶液ng/mL（0、0.25、0.5、1、2.5），其余孔内各加入 50μL待测样品提取液，随即在各孔分别加入50mLAFB1抗体和50μL酶结合物，摇匀，37℃避光温育30min。将温育后的抗体板取出，弃去未反应抗原溶液，用洗涤液洗涤4次。拍下后各孔分别加入100μL显色剂。37℃显色5min。往各孔中分别加入50μL终止液，立即用酶标仪在450nm波长处测定各孔OD值，并绘制标准曲线，计算出样品中的AFB1含量。

2 结果与分析

2.1 各种提取溶剂的配比比例对AFB1提取效果的影响

将5μg/kg、20μg/kg、50μg/kg三种浓度的AFB1标准品分别添加于花生油样品中，采用上述表1的配比设计进行提取处理，按1.3.2、1.4试验步骤，根据标准曲线测定AFB1的含量，每个浓度重复三次测定，同时做样品空白。计算各个配比的加标回收率。

从表2中可以说明，对于不同污染程度的花生油样品，各溶剂比例对回收率存在很大差异。对于低浓度的样品（加标5μg/kg），50%甲醇水回收率较好；其他回收率超过100%，容易造成假阳性；对于中度污染样品（加标20μg/kg），60%甲醇水回收率接近100%，比较理想；对于重度污染的样品（加标50μg/kg），80%甲醇水回收率最高。由于花生油的国家标准限量要求为≤20μg/kg，所以FLASH作为大量样品筛查的方法，采用甲醇/水（60：40）作为样品提取溶剂效果最佳。

2.2 分液漏斗振荡器转速对结果的影响

花生油样品处理固定振荡时间为15min，研究振荡速度对AFB1提取效果的影响，结果如图1所示。从图1可以看出，当转速达到250rpm后，AFB1测定值达到稳定，转速增大，测定结果变化不大。所以本优化方法选定分液漏斗振荡器转速为250rpm。

2.3 振荡时间对结果的影响

花生油样品处理固定振荡器转速为250rpm，研究振荡时间对AFB1提取效果的影响，结果如图2所示。从图2可以看出，AFB1与振荡时间成正比，当振荡时间达到15min时，AFB1测定值达到最大值。所以本优化方法选定振荡时间为15min。

2.4 pH值对结果的影响

当pH<4时，A1/A0较低，结果呈假阳性；当pH>8时，结果呈阴性。由于60%甲醇提取液的pH值为4～6之间，故需要用NaoH溶液调节pH为6～8，使酶活性在正常范围内，再进行提取和测定。

2.5 优化方法与国标方法（GB/T 5009.22-2003中第二法）的比较

选取10份花生油样品，以5μg/kg浓度加标，通过两种前处理方法，其回收率见表3。优化方法的回收率比国标法高。优化方法减少了人工操作，使用分液漏斗振荡器固定了转速，振荡时间，避免人为因素带来的误差，而国标法处理步骤繁琐，并且其凝结物不易完全溶解，粘附于蒸发皿上，降低回收率。因此，当前优化的前处理方法具有较好的实际操作与参考意义。

3 结语

本文探讨了ELISA法最佳提取黄曲霉毒素B1参数，分别考察了不同浓度的甲醇提取溶剂，分液漏斗萃取的不同振荡力度及频率，pH的调整对免疫反应的影响等。对国标GB/T 5009.22-2003中第二法ELISA测定花生油中黄曲霉毒素B1的样品前处理进行改良，提出了样品处理的最佳组合：使用60%甲醇提取液，分液漏斗萃取最優转速250rpm，振荡时间15min，样品提取物pH调节为6-8。本方法与国标比较，统一了操作者的振摇力度与频率，减少了人为操作，避免人为因素带来的误差，缩短了前处理时间。新改进方法下样品加标回收率在80～110%之间。本实验的意义在于提高了ELISA法检测花生油黄曲霉毒素B1的效率和准确度。

参考文献

[1]陈淑润.ELISA法检测大米、食用油中黄曲霉毒素B1前处理方法的研究[J].福建轻纺，2006，7：30-33.

[2]兰珊珊，刘宏程.梅文泉.杨芳，酶联免疫法测定不同食用植物油中黄曲霉毒素B1[J].粮食与油脂， 2006，4：39-41.

[3]GB/T 5009.22-2003，食品中黄曲霉毒素B1的测定[S].

[4]陈晓玲，戴晓瑛，罗建平.酶联免疫吸附法（ELISA）检测食用油中黄曲霉毒素B1[J].中国卫生检验杂志，2000，10（1）：59-60.