大孔吸附树脂HP20分离肉桂原花青素的研究

姜倩 张加研 秦永剑 刘祖广

摘要 [目的]研究HP-20大孔吸附树脂分离肉桂原花青素。[方法]采用HP-20大孔吸附树脂分离肉桂原花青素，将1 g原花青素原料溶解在少量60%乙醇中，制得的浓溶液匀速加入吸附柱中，分别用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇对吸附在树脂上的肉桂原花青素进行梯度洗脱，并分析各部分质量、纯度以及聚合度。[结果]各部分样品分别标记为F20、F40、F60、F80、F100，五部分的质量分别为0.24、0.19、0.17、0.27、0.02 g；五部分中，纯度最高的为F40部分，纯度为82.65%，纯度最低的为F100部分，纯度为65.11%；洗脱过程中原花青素回收率达89%；分析各浓度的乙醇洗脱液中原花青素平均聚合度发现，10%～40%乙醇洗脱液中主要为低聚体，而40%～100%乙醇洗脱液中主要为高聚体。[结论]该研究为下一步肉桂原花青素高聚体的降解后的分离提供理论依据。

关键词 原花青素；大孔吸附树脂HP-20；分离；聚合度

中圖分类号 S567 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2014）31-10919-03

Study on the Separation of Cinnamon Proanthocyanidins by Macroporous Resin HP-20

JIANG Qian1，ZHANG Jiayan1*，QIN Yongjian1 et al （College of Material Engineering，Southwest Forestry University，Kunming，Yunnan 650224）

Abstract [Objective] The research aimed to study study the separation of proanthocyanidins by macroporous resin HP-20.[Method]The starting material 1 g of procyanidin was dissolved in a small amount of 60% ethanol，the concentrated solution was added to adsorption column in a constant speed.Ethanol concentration of 20%，40%，60%，80%，100% was selected respectively in gradient eluting by macroporous resin HP-20，and the quality，purity，and polymerization degree of all parts of the samples were analyzed.[Result]Each parts of the samples were labeled F20、F40、F60、F80、F100，the quality of five parts was 0.24 ，0.19，0.17，0.27 and 0.02 g separately.In the five parts，the highest purity was F40，and its purity is 82.65%，the lowest purity was F100，its purity was 65.11%.The recovery rate of Proanthocyandins elution was 89%.Analysis of the average polymerization degree of proanthocyanidins in the concentrations of ethanol eluate found that the 10%-40% ethanol eluate contained mainly OPC，40%-100% ethanol eluate contained mainly PPC.[Conclusion] The study provides the theoretical basis for the next study for separation of polymeric proanthocyanidins from cinnamon.

Key words Proanthocyanidins；Macroporous resin HP-20；Separation；Polymerization degree

肉桂为樟科植物肉桂的干燥树皮^[1]，肉桂具有解痉止痛、解热、扩张血管、抗菌、抗肿瘤及促进免疫等药理作用^[2]。肉桂原产于斯里兰卡，该地产量约占世界总产量的70%，中国、东南亚以及世界许多热带地区均有栽种。我国肉桂的生产总量占世界的38.1%，主要分布于广西、云南、福建、海南等省份^[3]，而广西、广东两省肉桂产量占我国肉桂产量的95%以上^[4]。原花青素按照聚合度的大小，通常将二～四聚体称为低聚原花青素（OPC），五聚体以上的称为多聚原花青素（PPC），OPC与PPC相比，OPC在抗氧化、酶抑制、预防心血管疾病、抗癌、抗炎止痛、止血、增进免疫调节以及促进心脏缺血后复苏、防止动脉硬化、减少对皮肤的刺激和抗糖尿病等方面有显著的生物活性^[5]，其在体内的抗氧化能力是VE的50倍、Vc的20倍^[6]。Gu等对41种食品中原花青素的含量进行评价，发现肉桂中原花青素含量最高，但其中高聚原花青素占49.3%，低聚原花青素占50.0%，多聚原花青素由于受到空间位阻的影响，生物活性降低^[7]。因此为了有效发挥原花青素的抗氧化性，对原花青素进行分级处理，富集原花青素低聚体成分，能够提高原花青素生物功效。该试验采用资源丰富的广西肉桂皮为原材料，研究大孔吸附树脂HP20对肉桂原花青素按聚合度进行分离，为下一步肉桂原花青素高聚体降解后的分离提取提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

无水乙醇、甲醇、香草醛、盐酸（分析纯，上海国药集团有限公司），（+）-儿茶素、（-）-表儿茶素、原花青素（国家标准物质检定所）、2-巯基乙醇、TU1810DASP C型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、Agilent 1200series 高效液相色谱仪、BS-100A自动部分接收器、大孔吸附树脂HP20（北京慧德易科技有限责任公司）。

1.2 肉桂原花青素的制备

称取5.04 g（80～120目）肉桂皮粉末于500 ml三口烧瓶中，再向三口烧瓶中加入150 ml 60%乙醇，置于预先预热的50 ℃恒温水浴锅中，安装好冷凝管、磁力搅拌器搅拌，启动搅拌装置提取1.5 h，随后取出烧瓶并冷却至室温，过滤后，滤液利用石油醚萃取，萃取液用旋转蒸发器于45±5 ℃减压干燥，得到干燥原花青素初提物。

1.3 分级处理试验

將1 g肉桂原花青素原料溶解在少量60%乙醇中，制得的浓溶液匀速加入吸附柱中，依次用20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液进行梯度洗脱，分批收集不同百分比浓度乙醇的洗脱液。

1.4 原花青素的回收率以及含量测定

对各部分洗脱液于45±5 ℃温度下旋转蒸发回收溶剂，所得样品分别标为F20、F40、F60、F80、F100，在实验室现有条件下利用香草醛-盐酸法测定原花青素的含量，配制200 μg/ml的样品甲醇溶液，取0.5 ml样品加入10 ml比色管中后，依次加入3 ml浓度为4.0 g/100ml的香草醛-甲醇溶液，1.5 ml浓盐酸，加塞摇匀，在20±1 ℃避光条件下反应15 min后，于500 nm处测其吸光度，利用（+）-儿茶素作为标准品建立标准曲线算出待测液质量浓度，从而计算样品纯度^[8]。

1.5 聚合度测定

1.5.1 色谱分析条件。色谱柱为Agilent Analytical Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm ，0.5 μm）；流动相为A：水（含TFA 0.1%），B：乙腈体系（含TFA 0.1%）；梯度洗脱为0～40 min（4%～25% B）、40～45 min（25%～30% B）、45～55 min（30%～95% B）、55～65 min（95%～4% B）；柱温为30 ℃；流速为1.0 ml/min；进样量为10 μl；检测波长为280 nm。

1.5.2 （+）-儿茶素和（-）-表儿茶标准曲线的建立。配制不同浓度的（+）-儿茶素溶剂溶液，过滤后进行高效液相色谱分析，以（+）-儿茶素质量或（-）-表儿茶素质量为横坐标、峰面积为纵坐标建立标准曲线并拟合回归方程。

1.5.3 硫解目标产物标准曲线的建立。

1.5.3.1 硫解反应。

1.5.3.1.1 样品溶液配制。精确称取部分样品10 mg置于10 ml容量瓶，用 60%乙醇定容，得到浓度为1 mg/ml的样品溶液。

1.5.3.1.2 2-巯基乙醇反应液的配置。分别精确量取2.5 ml 2-巯基乙醇、27.5 ml乙醇、16 ml蒸馏水、4 ml 4%盐酸水溶液，充分混匀。

1.5.3.1.3 硫解反应。分别取100 μl样品溶液、400 μl 2巯基乙醇反应液于试管内，充分混匀，以100 μl 60%乙醇、400 μl 2-巯基乙醇反应液为对照。于70 ℃恒温水浴条件下反应4 h，放置室温冷却。

1.5.3.2 硫解产物的HPLC分析及产物的制备。利用硫解反应液、 2巯基乙醇标准品溶液、（+）-儿茶素、（-）-表儿茶素标准品进行高效液相色谱分析，得到反应产生的新化合物的波峰。将硫解反应扩大，反应后溶液经大孔树脂HP20吸附，用蒸馏水洗脱，除去剩余的2-巯基乙醇、盐酸等，利用甲醇洗脱后溶液用旋转蒸发蒸干后既得到硫解产物。将样品用少量蒸馏水溶解，上Sephadax柱，依次用400 ml 20%、40%、60%、80%甲醇洗脱，以薄层层析为指导合并洗脱液，再以高效液相色谱分析为指导，找到目标产物，将目标产物干燥；然后将目标产物用少量蒸馏水溶解上CG161M柱进行纯化，依次用200 ml 10%、30%、50%、70%、80%甲醇洗脱，以薄层层析为指导合并洗脱液，再以高效液相色谱分析为指导，找到目标产物，将目标产物命名为2MEec^[9]。

1.5.3.3 建立标准曲线。以制备的目标产物为标准品，配制不同浓度的标准品溶液，过滤后进行高效液相色谱分析，以目标产物为横坐标，以峰面积为纵坐标建立标准曲线并拟合回归方程。

1.5.4 平均聚合度的计算方法。待测样品按照“1.5.3.1”硫解反应的方法处理以后，经高效液相色谱分析检测得到其相对应的（+）-儿茶素、（-）-表儿茶素、2MEec的峰面积，再根据相对应的标准曲线计算得到相对应的物质的量，由公式mDP=计算出其平均聚合度。

2 结果与分析

2.1 分级处理试验结果

2.1.1 标准曲线的建立。以（+）-儿茶素为标准品所作的标准曲线如图1所示，拟合回归线性方程为y=353.516 2x-14.230 8，相关系数R2=0.999 6，其中y为质量浓度，μg/ml；x为吸光度。

2.1.2 分级处理试验中各部分纯度及回收率。

大孔吸附树脂对肉桂原花青素进行吸附，经20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液依次进行梯度洗脱，得到五部分样品，标记为F20、F40、F60、F80、F100，从表1可以看出，在五部分中总质量最大的是F80部分，其总质量为0.27 g，纯度为74.81%；纯度最高的是F40部分，其纯度为82.65%，其总质量为0.19 g；在五部分中总量以及纯度最低的是F100部分，其总质量为0.02 g，纯度为65.11%，整个过程回收率为89%。

3 结论与讨论

（1） 利用大孔吸附树脂HP20分离肉桂原花青素，分离产生五部分样品F20、F40、F60、F80、F100，总质量最大的是F80部分，其总质量为0.27 g，纯度为74.81%；纯度最高的是F40部分，其纯度为82.65%，总质量为0.19 g；在五部分中总量以及纯度最低的是F100部分，其总质量为0.02 g，纯度为65.11%，整个过程回收率为89%。

（2） 用不同浓度乙醇对吸附在HP20树脂上的原花青素进行梯度洗脱，洗脱液中原花青素的平均聚合度随乙醇浓度的提高而升高，当乙醇浓度<40%时洗脱液中原花青素的平均聚合度为2～5，可以认为主要为低聚体；当乙醇浓度>60%时，洗脱液中原花青素的平均聚合度为>5，可以认为主要为原花青素高聚体。

参考文献

[1]

赵凯，薛培凤，屠鹏飞.肉桂的化学成分及其生物活性研究进展[J].内蒙古医科大学学报，2013（1）：63-74.

[2]肖培根，李大鹏，杨世林.中药志，第2卷[M].北京：化学工业出版社，2002.

[3] 刘永华.国内外肉桂生产概况[J].经济林木，2001（10）：11.

[4] 陈家源，牙启康，卢文杰，等.中药肉桂的研究概况[J].广西医学，2009（6）：872-874.

[5] 李長运，吕敬慈，魏莎莎，等.肉桂高聚原花青素的氢化降解工艺研究[J].天然产物研究与开发，2009（4）：660-663.

[6] WOOD J E，SENTHI LMOHAN S T，PESKIN A V.Antioxidant activity of procyanidin-containing plant extracts at different pHs[J].Food Chemistry，2002，77（2）：155-161.

[7] GU L，KELM M A，HAMMERSTONE J F，et al.Concentrations of proanthocyanidins in common foods and estimations of normal consumption[J].The Journal of Nutrition，2004，134（3）：613-617.

[8] 赵平，宋学娟，张月萍，等.葡萄籽原花青素含量测定[J].河北化工，2007，30（1）：46-48.

[9] 李美娟.云南松树皮高聚原花青素的片段化研究[D].昆明：西南林业大学，2013.