两种双水相体系提取枇杷叶中黄酮的工艺研究

王 丽，费春芳

（常州工学院理学院，江苏 常州213022）

枇杷叶是传统中草药。目前从枇杷叶中分离的有效成分主要有挥发油、三萜酸类、倍半萜类、黄酮类、多酚类、有机酸类等[1－3］。从枇杷叶中提取黄酮的方法主要有：水浸提取法[4］、乙醇提取法[5］、超声波提取法[6］、微波辅助萃取法[7］等。由于双水相萃取技术[8］避免了有毒试剂的使用，能够提供温和的水环境，具有活性损失小等特点，因此，作者在此研究了聚乙二醇－硫酸铵和乙醇－硫酸铵两种双水相体系提取枇杷叶中黄酮的工艺过程，优化了提取工艺条件，并比较了两种体系的提取效率。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

枇杷叶采摘于常州工学院新北校区。

芦丁标准品，聚乙二醇2000，十二烷基苯磺酸钠（SDBS），十四烷基三甲基氯化铵（≥99%），硫酸铵，正丁醇，无水乙醇，氢氧化钠，硝酸铝，亚硝酸钠，均为分析纯。

TU－1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；FA1004B型电子天平，上海超平科学仪器有限公司；SK2210LHC型超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；TDL80型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；F80型高速粉碎机，江苏金坛金城国胜实验仪器厂；恒温水浴加热器，江苏金坛荣华仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枇杷叶处理

取新鲜的枇杷叶，洗净，于60℃烘箱中烘2h，用高速粉碎机粉碎，保存于试剂瓶中，待用。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制

分别 量 取 1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00 mL、5.00mL、6.00mL、7.00mL芦丁标准溶液置于7个25mL容量瓶（编号1＃～7＃）中，加入1.00mL 5%NaNO2溶液，轻轻摇匀，放置6min；加入1.00 mL 10%Al（NO3）3溶液，轻轻摇匀，放置6min；加入3.00mL 4%NaOH溶液，加水稀释至刻度，摇匀，放置15min；取6＃容量瓶，用紫外可见分光光度计扫描其波长，然后在最大波长下，以空白试剂作参比，测7组溶液的吸光度，以芦丁标准溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

本实验以E值（溶液的吸光度乘以稀释倍数和原液的体积后，除以原料的质量，正比于提取效率）表示提取效率，进行提取工艺的优化及提取效率的比较。

1.2.3 黄酮提取及含量测定

聚乙二醇－硫酸铵体系：取25mL比色管，加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸铵、0.3g枇杷叶粉、pH 值为9的缓冲溶液至10.0mL，于40℃提取1.5h，取上层清液，按黄酮的亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠检测法[9］处理，于497.5nm处测定吸光度，计算E值。

乙醇－硫酸铵体系：取25mL比色管，加入4.0mL无水乙醇、1.8g硫酸铵、0.2g枇杷叶粉、去离子水至10.0mL，于40℃提取1.0h。取上层清液，同法处理，于波长497.5nm处测定吸光度，计算E值。

2 结果与讨论

2.1 最大吸收波长的确定

按1.2.2方法用紫外可见分光光度计扫描，确定芦丁的最大吸收波长为497.5nm。

2.2 芦丁的标准曲线（图1）

图1 芦丁的标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

由图1可知，芦丁浓度与吸光度的线性关系良好。

2.3 聚乙二醇－硫酸铵体系中各因素对黄酮提取效率的影响

2.3.1 聚乙二醇用量对提取效率的影响

在聚乙二醇－硫酸铵体系中分别加入不同量（1.5 g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g）的聚乙二醇，然后加入1.5g硫酸铵、0.3g枇杷叶粉、pH值为9的缓冲溶液至10.0mL，于40℃提取1.5h，测定吸光度，考察聚乙二醇用量对提取效率的影响，结果见图2。

图2 聚乙二醇用量对提取效率的影响Fig.2 Effect of the amount of PEG on extraction efficiency

由图2可知，聚乙二醇用量为2.0g时，E值最大，提取效率最高。因此，选取聚乙二醇用量为2.0g。

2.3.2 硫酸铵用量对提取效率的影响

在聚乙二醇－硫酸铵体系中加入2.0g聚乙二醇、不同量（1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g）的硫酸铵，然后加入0.3g枇杷叶粉、pH值为9的缓冲溶液至10.0mL，于40℃提取1.5h，测定吸光度，考察硫酸铵用量对提取效率的影响，结果见图3。

图3 硫酸铵用量对提取效率的影响Fig.3 Effect of the amount of ammonium sulfate on extraction efficiency

由图3可知，硫酸铵用量为1.5g时，E值最大，提取效率最高。因此，选取硫酸铵用量为1.5g。

2.3.3 pH值对提取效率的影响

在聚乙二醇－硫酸铵体系中加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸铵、0.3g枇杷叶粉、不同pH 值（7、8、9、10、11）的缓冲溶液，于40℃提取1.5h，测定吸光度，考察pH值对提取效率的影响，结果见图4。

图4 pH值对提取效率的影响Fig.4 Effect of the pH value on extraction efficiency

由图4可知，缓冲溶液的pH值为9时，E值最大，提取效率最高。因此，选取缓冲溶液的pH值为9。>

2.3.4 料液比对提取效率的影响

在聚乙二醇－硫酸铵体系中加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸铵、不同量（0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5 g）的枇杷叶粉、pH值为9的缓冲溶液至10.0mL，使料液比（g∶mL，下同）分别为0.1∶10、0.2∶10、0.3∶10、0.4∶10、0.5∶10，于40℃提取1.5h，测定吸光度，考察料液比对提取效率的影响，结果见图5。

图5 料液比对提取效率的影响Fig.5 Effect of the solid－liquid ratio on extraction efficiency

由图5可知，料液比为0.3∶10时，E值最大，提取效率最高。因此，选取料液比为0.3∶10。

2.3.5 提取时间对提取效率的影响

在聚乙二醇－硫酸铵体系中加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸铵、0.3g枇杷叶粉、pH值为9的缓冲溶液至10.0mL，于40 ℃分别提取不同时间（0.5h、1.0 h、1.5h、2.0h、2.5h），测定吸光度，考察提取时间对提取效率的影响，结果见图6。

图6 提取时间对提取效率的影响Fig.6 Effect of the extraction time on extraction efficiency

由图6可知，提取时间为1.5h时，E值最大，提取效率最高。因此，选取提取时间为1.5h。

2.3.6 提取温度对提取效率的影响

在聚乙二醇－硫酸铵体系中加入2.0g聚乙二醇、1.5g硫酸铵、0.3g枇杷叶粉、pH值为9的缓冲溶液至10.0mL，分别在不同温度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50℃、60℃）下提取1.5h，测定吸光度，考察提取温度对提取效率的影响，结果见图7。

由图7可知，提取温度为40℃时，E值最大，提取效率最高。因此，选取提取温度为40℃。

2.4 乙醇－硫酸铵体系中各因素对黄酮提取效率的影响

2.4.1 无水乙醇用量对提取效率的影响

图7 提取温度对提取效率的影响Fig.7 Effect of the extraction temperature on extraction efficiency

在乙醇－硫酸铵体系中加入不同量（3.0mL、3.5 mL、4.0mL、4.5mL、5.0mL）的无水乙醇、1.8g硫酸铵、0.2g枇杷叶粉、去离子水至10.0mL，于40℃提取1.0h，测定吸光度，考察无水乙醇用量对提取效率的影响，结果见图8。

图8 无水乙醇用量对提取效率的影响Fig.8 Effect of the amount of anhydrous ethanol on extraction efficiency

由图8可知，当无水乙醇用量为4.0mL时，E值最大，提取效率最高。因此，选取无水乙醇用量为4.0 mL。

2.4.2 硫酸铵用量对提取效率的影响

在乙醇－硫酸铵体系中分别加入不同量（1.5g、1.8g、2.1g、2.4g、2.7g）的硫酸铵、4.0mL无水乙醇、0.2g枇杷叶粉、去离子水至10.0mL，于40℃提取1.0h，测定吸光度，考察硫酸铵用量对提取效率的影响，结果见图9。

由图9可知，当硫酸铵用量为1.8g时，E值最大，提取效率最高。因此，选取硫酸铵用量为1.8g。

2.4.3 料液比对提取效率的影响

在乙醇－硫酸铵体系中加入1.8g硫酸铵、4.0mL无水乙醇、不同量（0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g）的枇杷叶粉、去离子水至10.0mL，使料液比分别为0.1∶10、0.2∶10、0.3∶10、0.4∶10、0.5∶10，于40℃提取1.0h，测定吸光度，考察料液比对提取效率的影响，结果见图10。

图9 硫酸铵用量对提取效率的影响Fig.9 Effect of the amount of ammonium sulfate on extraction efficiency

图10 料液比对提取效率的影响Fig.10 Effect of the solid－liquid ratio on extraction efficiency

由图10可知，当料液比为0.2∶10时，E值最大，提取效率最高。因此，选取料液比为0.2∶10，即枇杷叶粉用量为0.2g。

2.4.4 提取时间对提取效率的影响

在乙醇－硫酸铵体系中加入1.8g硫酸铵、4.0mL无水乙醇、0.2g枇杷叶粉、去离子水至10.0mL，于40℃分别提取不同时间（0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h），测定吸光度，考察提取时间对提取效率的影响，结果见图11。

图11 提取时间对提取效率的影响Fig.11 Effect of the extraction time on extraction efficiency

由图11可知，提取时间为1.0h时，E值最大，提取效率最高。因此，选取提取时间为1.0h。

2.4.5 提取温度对提取效率的影响

在乙醇－硫酸铵体系中加入1.8g硫酸铵、4.0mL无水乙醇、0.2g枇杷叶粉、去离子水至10.0mL，分别于不同温度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃）下提取1.0h，测定吸光度，考察提取温度对提取效率的影响，结果见图12。

图12 提取温度对提取效率的影响Fig.12 Effect of the extraction temperature on extraction efficiency

由图12可知，提取温度为40℃时，E值最大，提取效率最高。因此，选取提取温度为40℃。

2.5 两种体系的提取效果比较（表1 ）

表1 两种体系提取枇杷叶中黄酮的效果（n＝3）Tab.1 Extraction efficiency of flavonoids from loquat leaves in the two systems（n＝3）

由表1 可知，乙醇－硫酸铵体系中的黄酮提取效率要优于聚乙二醇－硫酸铵体系。

3 结论

以枇杷叶为原料，利用双水相体系提取黄酮。结果表明：聚乙二醇－硫酸铵体系中，在聚乙二醇用量为2.0g、硫酸铵用量为1.5g、料液比为0.3∶10、pH 值为9、提取温度为40℃、提取时间为1.5h的条件下，提取效率最高，达5.80%；乙醇－硫酸铵体系中，在无水乙醇用量为4.0mL、硫酸铵用量为1.8g、料液比为0.2∶10、提取温度为40℃、提取时间为1.0h的条件下，提取效率最高，达7.49%。该方法具有操作简便、条件温和、设备简单、成本较低、效率较高的优点，为枇杷叶的开发利用提供了较好的参考依据。

[1]蔡建秀.枇杷叶、枝条及果实总黄酮含量比较及抗氧化分析[J］.泉州师范学院学报（自然科学版），2010，28（4）：55－59.

[2]冯国宣.抗癌植物资源与天然产物研究[J］.湖北民族学院学报（自然科学版），2001，19（3）：26－32.

[3]陈颢，李丽娟，李良，等.中药材中黄酮类化合物的提取及药理作用研究进展[J］.云南化工，2011，38（4）：50－52.

[4]林启训.枇杷叶黄酮类化合物的水浸提工艺研究[J］.农业工程学报，2005，21（7）：190－193.

[5]钱剑林.白沙枇杷叶黄酮类物质提取工艺的研究[J］.食品科学，2007，28（7）：252－254.

[6]周振，黎中良.超声波辅助提取枇杷叶中黄酮类化合物的工艺研究[J］.玉林师范学院学报，2008，29（3）：60－64.

[7]玉澜，张春艳.微波辅助提取枇杷叶黄酮类化合物工艺的优化[J］.南方农业学报，2013，44（6）：1018－1021.

[8]吕斌，陈有容，陈舜胜.双水相萃取技术及其在生物、食品工业中的应用[J］.食品与发酵工业，2001，27（6）：70－74.

[9]夏稼红，陶冉，范乃兵，等.紫外分光光度法测定莲子心总黄酮的含量[J］.南京中医药大学学报，2008，24（2）：116－118.