胃动素对大鼠下丘脑PVN神经元细胞电压依赖性钾电流的影响

韩波等

【摘要】 目的：研究胃动素对大鼠下丘脑PVN神经元细胞电压依赖性钾电流的影响。方法：采用急性分离新生Wistar大鼠下丘脑细胞和全细胞膜片钳技术的方法，观察胃动素对大鼠下丘脑PVN神经元细胞电压依赖性钾电流的影响。结果：胃动素可抑制大鼠下丘脑PVN神经元电压依赖性钾电流，使电流由（5.406±0.86）nA降至（3.621±0.78）nA，差异有统计学意义（P<0.05）。步进电刺激下丘脑神经元，随着刺激电压强度的增强，钾外向电流增加，使电压-电流曲线（Ⅰ～Ⅴ曲线）右移，但不改变Ⅰ～Ⅴ曲线的形态。结论：胃动素可通过抑制大鼠下丘脑PVN神经元细胞电压依赖性钾电流，发挥其增强胃肠运动的作用。

【关键词】 胃动素； 下丘脑PVN细胞； 全细胞膜片钳技术； 电压依赖性钾电流

【Abstract】 Objective：To study the influence of motilin on the voltage-dependent K+ current of hypothalamic PVN neurons.Method：Patch clamp experiment：rat hypothalamic PVN neurons cells were acute dissociated and observed the influence of motilin on voltage-dependent K+ current of hypothalamic PVN neurons using whole-cell patch-clamp techniques.Result：Motilin could inhibit the voltage-dependent K+ current of rat hypothalamic PVN neurons.The current was decreased from （5.406±0.86）nA to （3.621±0.78）nA，the difference was statistically significant（P<0.05）.Step electric stimulation of hypothalamic neurons，with stimulus voltage strength increased，outward potassium current increased，and the Ⅰ-Ⅴ curve shifted right，but the form of the Ⅰ-Ⅴ curve was not changed.Conclusion：Motilin can enhance the motility of gastrointestinal through inhibiting the voltage-dependent K+ current of hypothalamic PVN neurons.

【Key words】 Motilin； Hypothalamic PVN neurons； Whole-cell patch clamp； Voltage-dependent K+ current

First-authors address：The Peoples Hospital of Weicheng District in Weifang City，Weifang 261021，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.005

众所周知，下丘脑是一个重要的饮食调节中枢。下丘脑位于前脑底部，主要有内侧区和外侧区组成，其内存在一个食欲调节网络，并受生物节律的影响[1-3]。下丘脑弓状核（ARC）、腹内侧区（VMH）、背内侧核（DMN）、室旁核（PVN）、视交叉上核（SCN）和外侧区（LHA）等均是“网络中心”的重要组成部分。其中VMH被称为饱食中枢，电刺激VMH可抑制摄食，而损毁双侧VMH则导致摄食过量和肥胖[4]。现在普通认为，PVN是中枢神经调节胃肠运动的重要中枢。有研究发现，下丘脑的弓状核参与胃动素对胃肠运动的调节，另外在脑脊液中注射胃动素相关肽ghrelin可导致下丘脑PVN、DMN、VMH的c-fos表达增加，同时孤束核（NTS）c-fos的表达也有增加，并通过迷走神经激活下丘脑促食欲神经肽Y介导的生长素受体的激活[5-7]。

胃动素是一种由22种氨基酸组成的脑肠肽，空腹时由小肠上端黏膜合成并呈周期性释放，具有促进胃排空和增强胃肠运动的作用[8]。许多研究证明，大鼠脑内存在着胃动素免疫反应阳性神经元。胃动素在大鼠脑内的分布和其他神经肽不同，以小脑的胃动素浓度最高。在下丘脑内侧基底部和正中隆起具有中等浓度的胃动素分布，提示脑内的胃动素能神经元可能具有神经内分泌作用[9]。临床已有报道称，静脉内给予胃动素能够加速胃排空的速率和增强胃癌患者消化间期移行性综合波三期的运动[10]。多项研究表明，胃动素促进胃肠运动主要在PVN通过PVN-延髓（DVC）-迷走神经轴实现[11-12]。但是，胃动素怎样通过影响下丘脑PVN神经元细胞的通道实现调节胃肠运动的作用还未有报道。本文运用全细胞膜片钳技术观察胃动素对下丘脑PVN神经元细胞电压依赖性钾电流的作用，来进一步探讨其调节胃肠运动的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 新生1～3 d的Wistar大鼠7只，由潍坊医学院实验动物中心提供。胃动素（Sigma公司）、胰蛋白酶、蛋白酶（protease E）（solarblo公司），HEPES（sigma公司），其余均为国产分析纯。人工脑脊液（ACSF）：NaCl 126 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl2 2 mmol/L，MgSO4

2 mmol/L，NaHCO3 5 mmol/L，NaH2PO4 1.5 mmol/L，endprint

Glucose 10 mmol/L（现配）。通95%O2+5%CO2混合氧，调节pH至7.4。标准细胞外液：NaCl 150 mmol/L，KCl 5 mmol/L，CaCl2 2 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，D-Glucose 10 mmol/L，MaCl2 1 mmol/L，NaOH调节pH至7.4。电极内液：KCl 140 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，HEPES

10 mmol/L，MaCl2 1 mmol/L，Na2ATP 4 mmol/L，用KOH调节pH至7.4。

1.2 细胞分离 根据Paxions-Watson图谱，运用酶解以及机械法消化大鼠下丘脑PVN神经元细胞。在0～4 ℃的孵育液中孵育后，取出组织，在ACSF中剪成约

1 cm3的组织块，室温静置30 min。在含0.05%胰酶的缓冲液中于32 ℃通氧消化30 min，冲洗两遍，将组织块置于含0.05%蛋白酶E的缓冲液中进行二次消化。弃去消化液，放置在含2 mL细胞外液的35 mm的培养皿中，轻轻吹打成细胞悬液，静置20 min待细胞贴壁后，即可进行膜片钳记录。为了阻断Ca2+和Na+通道，实验开始前加入CdCl2（200 ?M）和TTX（1.2 ?M）。

1.3 全细胞膜片钳记录 玻璃微电极由微电极拉制仪（PP-83，Narishige，Japan）分两步拉制，尖端直径为1～2 μm，充灌内液后电极阻抗为2～4 MΩ。运用EPC9膜片钳放大器（HEKA，Germany）进行全细胞模式的电压钳记录，当电极入液后加负压破膜，使电极内液与细胞内液相通，形成全细胞记录模式，待破膜稳定后补偿慢电容（Cs）以及局部串联电阻（Rs），随即开始进行记录，刺激频率为1 KHz，采集频率为2 KHz。实验过程中Rs<25 MΩ且电流稳定的数据被看作有效数据。所有实验均在20～25 ℃室温下进行。

1.4 给药方法 采用微量注射器快速给药（胃动素最终浓度为10-6 mol/L），观察给药前后下丘脑PVN神经元细胞电压依赖性钾电流的变化和电流-电压曲线（Ⅰ～Ⅴ曲线）的改变。每次给药实验结束后经灌流冲洗1 min再行下次加药观察。

1.5 统计学处理 所有数据结果分析均在HEKA Pulsefit 8.5和Origin 6.0软件上完成，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃动素对下丘脑PVN神经元细胞电压依赖性钾电流峰值的影响 待急性分离的细胞贴壁后，使用ACSF灌流冲洗，洗去未贴壁的细胞，镜下观察选取胞膜完整清晰，立体感强的细胞进行操作。在钳制电压-80 mV、刺激电压（Vt）30 mV条件下，记录给药前后下丘脑神经元细胞电压依赖性钾电流的改变。结果显示，给予胃动素（终浓度10-6 mol/L）2～3 min后，电刺激下丘脑神经元细胞，钾外向峰值电流明显降低，峰值电流由（5.406±0.86）nA降至（3.621±0.78）nA，降低了（24.01±6.39）%（P<0.05），见图1。

3 讨论

当摄入食物时，其食物成分刺激消化道的感官细胞，产生的信号由迷走神经，通过一系列的级联反应，传入抬到脑干孤束核。然后从孤束核将这内脏资讯传递到大脑的其他不同部位，发挥其参与内分泌，植物神经和行为效应的作用。有研究表明，当注入下丘脑或入脑室胃动素会增加胃肠蠕动，提示下丘脑是胃动素作用一个主站点[13]，而且是通过PVN-DVC-迷走神经轴实现。胃动素在食物的消化中起着重要的作用，它在消化间期呈周期性释放，并可刺激消化道的机械和细胞电运动，并可引起胆汁的分泌[14]。胃动素及其受体分布广泛，不仅存在于胃肠等外周器官，在中枢神经系统如下丘脑、海马、丘脑、垂体、松果体等也有广泛的存在[15]。最近研究发现，在甲状腺癌患者中也发现了胃动素的表达，并通过血液运输影响胃肠运动和PNV的调节功能[16]。以前有研究表明，在大鼠的下丘脑室旁核（PVN）内给予胃动素和胃动内酯后，可加强大鼠的胃运动，还可诱导PNV中立早基因c-fos的表达，这都表明中枢尤其是下丘脑的胃动素参与了胃肠运动的调节[6]。

钾通道在人体的各种生理活动中起着非常重要的作用，其主要由电压依赖性、受体偶联性、钙敏感及ATP敏感性钾通道组成，而电压依赖性钾通道是其家族中的重要成员。电压依赖性钾通道主要由快速失活A型通道和毒蕈碱敏感的M通道组成，尤其是快速失活性钾通道广泛分布在神经元中，主要功能是产生动作电位，它的开启受细胞膜电位的控制，从而调节神经元的放电及其兴奋，发挥其生理特性。电压依赖性钾电流在在受到外来刺激后，可产生外向电流，改变细胞的静息膜电位，影响细胞的基本电节律及其动作电位。

本研究发现，胃动素可显著地抑制大鼠下丘脑PVN神经元细胞的电压依赖性钾电流，峰值电流从（5.406±0.86）nA降至（3.621±0.78）nA，Ⅰ-Ⅴ曲线右移，但是形态无明显改变。因电压依赖性钾电流主要影响动作电位的时程，当钾电流被抑制时，动作电位的时程可延长，而导致钙电流内流增加，进而影响神经递质的释放。本课题组以前发现，胃动素受体激动剂红霉素也可抑制小鼠海马神经元电压依赖性钾电流，此次结果从而验证了PVN与海马等调节胃肠功能的神经中枢有着密切的联系，也证实胃动素可在影响中枢神经元细胞静息电位的基础上，发挥其增强胃肠运动的作用。由于Ca2+也可作为信号转导途径的第二信使发挥其生理作用，具体通过哪种转导途径，将在以后研究中进行探讨。

参考文献

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（收稿日期：2014-02-27） （本文编辑：欧丽）endprint

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