干旱和盐碱共胁迫下玉米EST文库的构建与分析

李德全， 谈 蓉， 张 洁， 周鸣鸣

(1.南通大学生命科学学院，江苏 南通 226019;2.南通大学农业部南方平原玉米科学观测实验站，江苏 南通 226019)

影响玉米产量和品质最大的非生物逆境胁迫是干旱，每年全世界玉米产量损失中的一半几乎是由干旱造成的。全国平均每年受旱面积2.17×107hm2，成灾面积8.9×106hm2，直接减收粮食 1×1010kg以上［1］。中国旱地农业的范围，大致指沿昆仑山-秦岭-淮河一线以北的干旱、半干旱和半湿润易旱地区，包括15个省(市、自治区)的965个县(市)，土地总面积为5.42×106km2，占全国总耕地面积的52%，这一地区也是中国玉米的重要产区。

如同其他植物一样，玉米可能遭受的逆境多种多样，且常常是多因子的综合作用。因此，植物在适应一种逆境的同时，对其他的逆境胁迫也表现了一定的抵抗力，这就是植物的交叉适应(Cross-adaption)现象。植物对逆境的交叉适应具有普遍性。已有的一些资料表明，植物对逆境的适应可能存在共同的机制［2］。干旱和盐碱胁迫同属水分渗透胁迫，其主要的生理变化机制是一致的［3］。根据近年来研究发现，不同玉米种质间的抗旱能力具有明显的差异，差异本质体现在基因水平上。我们对正常生长及干旱和盐碱共胁迫下的玉米品系YQ7-96雌雄分化期(12片真叶)的EST数据库进行研究，并对其EST进行初步分析，为找出玉米主栽高产品种分子育种基因标记探针提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米品系YQ7-96由广西大学农学院吴子恺教授提供。

1.2 方法

1.2.1 干旱和盐碱胁迫处理 玉米种子催芽后待根长2～3 cm时，点种于营养盘中，Hoagland营养液培养，置于网室。干旱和盐碱共胁迫处理:在雌雄分化盛期(大喇叭口期，大约12片真叶)，每盆浇5 L含20%(质量与体积比)PEG8000和总浓度100 mmol/L 的混合盐(25 mmol/L NaCl、25 mmol/L Na2SO4、25 mmol/L NaHCO3和 25 mmol/L Na2CO3)的 Hoagland(pH11，水势为-0.7 MPa)，以每盆浇5 L的Hoagland营养液作为对照。处理24 h、48 h和72 h后，采集玉米的茎、叶和花器组织，立即用液氮冷冻后保存于-80℃备用。

1.2.2 mRNA的纯化 用Trizol方法提取总RNA。然后按照FastTrackOR2.0Kit(Invitrogen)试剂盒的操作说明从总RNA中提取mRNA。

1.2.3 EST文库构建 按照CreatorTMSMARTcDNALibraryConstructionKit(CLONTEECH)试剂盒操作说明进行。

1.2.4 EST文库克隆片段长度筛选 PCR正向引物5'-AACAGCTATGACCATG-3'，反向引物5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'。反应条件:96℃变性10 min;94℃ 35 s，52℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30个循环;72℃ 10 min。

1.2.5 EST序列分析与注释 同源性比较参数的得分值与匹配碱基数和同源性相关EST的组装分析按照文献［4］的方法进行。按照 http://www.ncb.inlm.nih.gov/blastX/和MIPS网站提供的各种生物信息学在线分析工具对EST在线完成比对。

2 结果

2.1 EST文库构建

对克隆的cDNA 5'端进行测序，初步共计测序3 072条cDNA序列(cDNA的5'端序列)。经过校正，3 072条序列中符合要求的(测序中氮比例＜5.0%，外源长度＞150 bp，且是非线粒体，非 rRNA序列)共有2 098条ESTs序列，占总测序数量的68.3%。

符合要求的ESTs序列从文本格式转换为通用的FASTA格式。再利用vector_screen软件扫描去除有效序列上的载体上的序列，同时屏蔽序列上所有的Poly(A)。清洁后的序列进行序列组装分析，结果得到168个重叠群(Contig)，1 693条单拷贝ESTs，共计1 861条独立基因(Unigene)。这1 861条ESTs的频率分布见表1。从表1中可以看出，ESTs表达频率在1到10之间，其中表达频率10的只有1个独立基因，表达频率4以上的有17个独立基因，而单拷贝基因有1 693个。表明数据库中高频表达的基因较少，大部分为单拷贝基因。

2.2 干旱和盐碱共胁迫下早期诱导蛋白质的ESTs

在基因注释中发现了4个编码早期干旱诱导蛋白质的ESTs，在聚类分析后得到一个片段重叠群，命名为EDIP。BlastN比对分析显示:在核酸水平上与玉米、水稻的早期干旱诱导蛋白质相关基因有较高的同源性(分别是91%和87%)。再通过BlastX软件比对分析显示，EDIP序列与多种禾本科植物的水份胁迫响应蛋白质有较高的同源性(表2)。

对发现的4个干旱胁迫响应蛋白质和EDIP推断的ORF编码蛋白质序列利用VectorNTI软件进行序列一致性分析，其中一段序列约50个氨基酸在几种蛋白质中均是比较保守的(图1)。

表1 2 098条ESTs的表达频率分布Table 1 Distribution of expression frequency in 2 098 ESTs

表2 核酸数据库中的EDIP编码产物同源性序列值比较Table 2 The homology of EDIP sequence with drought-induced protein related genes in rice and Arabidopsis

图1 EDIP序列与4种胁迫响应蛋白质序列比较Fig.1 Sequence alignment between EDIP deduced protein and four kinds of stress response proteins

3 讨论

作为旱地玉米，抗旱能力的强弱决定了水分利用效率和需水总量。玉米的抗旱机制有3种:躲旱(Drought escape)、避旱(Drought avoidance)和耐旱(Drought tolerance)，其中避旱和耐旱统称为抗旱性(Drought resistance)。躲旱是植株在严重的水分胁迫发生之前完成其生活周期的能力。避旱是在水分胁迫发生时，植株通过维持组织的高水势或以组织水势略微下降来忍受干旱的能力。耐旱则是随着水势的降低，植物组织的生理活动或代谢活动下降较低的能力。利用早熟品种躲旱，虽然适应干旱环境，但由于早熟性，其产量潜力不大。因此目前大多数育种专家都倾向于抗旱性育种。

目前，多种分子生物学技术用于植物抗旱性的研究。图位克隆技术(Map based cloningor positional cloning)，其基本工作思路为构建含目的基因区域的精细物理图谱，利用该物理图谱采用染色体步行(Chromosome walking)的方法逐步逼近目的基因。精细定位及克隆数量性状位点(QTL)认为是21世纪遗传学家面临的最大挑战，但玉米基因组中60%～80%是重复序列，并且基因间重复DNA主要是以巢式插入形式的逆转座子［4-5］。逆转座子在过去的 2.00×106～6.00×106年内得到大量扩增，到现在占了玉米核基因组一半以上。这些基因组的特点无疑给玉米QTL克隆带来了负面影响;另外，定位的准确性不高、分子标记不是基因(其变异并不能完全解释性状的遗传变异)等方法上的原因也会对实际育种带来不利影响。

应用高通量EST技术陆续发现与水分胁迫相关的新QTL克隆。Reddy等从干旱胁迫下水稻cDNA文库中筛选出1 000个EST序列，其中主要在叶片和根部，具有和金属硫蛋白(Metallothioneins)、LEA(Late embroyonic abundant proteins)、热激蛋白(Heat-shock proteins)、细胞色素P450等渗透相关的基因［6］。Babu等从干旱处理条件下水稻cDNA文库中得到1 540条高质量EST序列。通过Blast比对分析，559条EST有功能注释;比对中还发现了与GenBank上无同源信息的EST序列，这些文库中特有的序列可能与干旱胁迫具有相关性［7］。Watkinson等建立了火炬松在中度干旱胁迫和重度干旱胁迫下的cDNA文库，得到了213个克隆。通过数据库EST功能分布比较显示了重度干旱胁迫对光合作用的影响远大于中度干旱胁迫［8］。

本研究对干旱和盐碱共胁迫下的玉米EST数据库进行分析，发现高频表达的基因较少，大部分为单拷贝基因。另外，筛选出与干旱和盐碱共胁迫相关的EST，在聚类分析后得到一个片段重叠群，命名为EDIP。

［1］ 张正斌，徐 萍，张建华，等.作物抗旱节水相关基因的标记和克隆及转基因研究进展［J］.西北植物学报，2002，22(6):1537-1544.

［2］ 王翠亭.高等植物中的逆激蛋白及交叉适应综述［J］.保定师专学报，1999，12(4):32-35.

［3］ 彭立新，李德全，束怀瑞.植物在渗透胁迫下的渗透调节作用［J］.天津农业科学，2002(8):38-43.

［4］ CHEN M，SANM P，BENNETZEN JL，et al.Microcolinearity in sh2-homologous regions of the maize，rice，and sorghum genomes［J］.PNAS，1997，94:3431-34357.

［5］ ALEXANDER P，TIKHONOV P，HILLIP JSM，et al.Colinearity and its exceptions in orthologous adh regions ofmaize and sorghum［J］.PNAS，1999，96:7409-7414.

［6］ REDDY A R，RAMAKRISHNAW，SEKHAR A C，et al.Novel genes are enriched in normalized cDNA libraries from droughtstressed seedlings of rice(Oryza sativaL.subsp.indicacv.Nagina 22)［J］.Genome，2002，45(1):204-211.

［7］ BABU P R，SEKHAR A C，ITHAL N，et al.Annotation and BAC/PAC localization of nonredundantESTs from drought-stressed seedlings of an indica rice［J］.Genet，2002，81(1):25-44.

［8］ WATKINSON J I，SIOSON A A，VASQUEZ-ROBINETC，et al.Photosynthetic acclimation is reflected in specific patterns of gene expression in drought-stressed loblolly pine［J］.Plant Physiol，2003，133(4):1702-1716.