转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

申爱娟， 陈 松 周晓婴 戚存扣

(1.南京农业大学农学院，江苏 南京 210095;2.国家油料作物改良中心南京油菜分中心，江苏 南京 210014;3.农业部长江下游棉花与油菜重点实验室，江苏 南京 210014)

随着转基因作物在世界范围内商品化种植面积的日益扩大，对转基因植物或产品检测的需求日益增加，转基因检测技术发展迅速。目前已经开发出多种基于蛋白质和核酸的转基因检测技术［1-14］，其中PCR检测技术因具有效率高、特异性强、可实现高通量且成本低廉的特点而得到广泛应用。根据检测目标的差异，PCR检测技术可细分为筛选检测、基因特异性检测、载体特异性检测和事件特异性检测方法。筛选检测主要是针对一般性常用基因元件如CaMV 35S启动子、NOS终止子和选择标记基因的检测，通常用于一般性转基因成份的筛查;而基因特异性检测是对特殊基因的检测如抗除草剂基因等的检测［7］;这2种检测方法均难以区分含有相同的基因元件、选择标记基因或功能基因的不同的转基因植物或产品。此外CaMV 35S启动子、NOS终止子作为存在于植物病原菌中的天然的DNA片段，有可能造成检测的假阳性［9］;而载体特异性检测是针对载体构建特点设计的检测技术［10］，其专一性相对较高，但是仍不能区分同一载体转化获得的不同转基因植物。而事件特异性检测是基于转基因TDNA位点旁侧序列特征建立起的PCR检测技术。由于转化过程中含有外源基因的T-DNA序列随机插入到受体基因组中，因此每一个独立、稳定的转化事件都是特异性的。根据旁侧序列设计引物，扩增包括部分T-DNA序列和部分基因组序列的融合序列，即所谓的转化事件特异性检测。转化事件特异性检测方法已经被应用于多种转基因作物的检测中［11-15］。

油菜属十字花科芸薹属植物，是世界上种植面积较大的4种油料作物之一。菜籽油用途广泛，可以用作食用油、生物柴油，也是油漆、软化剂、表面活性剂等的加工原料;菜籽饼中蛋白质含量高达40%，是优质的蛋白质饲料来源。由于油菜的经济利用价值高，且与模式植物拟南芥同属，易于转化，因此是转基因研究与应用最活跃作物之一。国内外转基因油菜的研究涉及到多种性状，包括抗除草剂、抗虫、抗病、耐逆、雄性不育及品质改良等，其中抗除草剂是商品化应用最广泛的性状，抗除草剂油菜在美国、加拿大、澳大利亚均有大规模种植。

转基因油菜W-4品系系江苏省农业科学院经济作物研究所油菜研究室通过农杆菌转化法将油菜fad2基因的ihpRNAi载体转入甘蓝型油菜Westar品种获得的高油酸品系［16］。W-4品系种子中油酸含量达到80%以上，亚油酸、亚麻酸含量降低至3%～4%，且高油酸性状能稳定遗传，具有潜在应用价值。本研究通过TAIL-PCR法分离转基因高油酸油菜W-4品系的T-DNA插入位点左右两侧的旁侧序列，并根据旁侧序列设计特异性PCR扩增引物，据此建立W-4转化事件的特异性检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 转基因甘蓝型油菜高油酸株系W-4系江苏省农业科学院经济作物研究所油菜研究室培育，其他转基因甘蓝型油菜株系T2、T3、A8、B6、R49、R54以及非转基因对照甘蓝型油菜Westar均为江苏省农业科学院经济作物研究所油菜研究室中保存。所有转基因株系均含有卡那霉素抗性基因。

1.1.2 扩增引物 左边界旁侧序列验证引物，LBR1:5'-TGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGA-3';LBR2:5'-GCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGC-3';LBR3:5'-CCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC-3';LBF:5'-GTCGAGTGATATGAACTATGTGCAGG-3'。右边界旁侧序列验证引物，RBF1:5'-ACTAATTGGATGACAAAGCAAATGG-3';RBF2:5'-GGACGCAGTCAGAAAGTCCAGAATG-3';RBF3:5'-GAAAACCCTGGCGTCCAACTTA-3';RBR:5'-TCCCAAATAGTTTGAATTGTTGAAG-3'。左边界事件特异性扩增引物，TLF:5'-TCTTGAGATCCTTACCAATAGAGC-3';TLR:5'-TCCATAATAATGTGGAGTAGTTCC-3'。右边界事件特异性引物，TRF:5'-AAGGAATCAATCACCGATGAAGAAAGC-3';TRR:5'-GAACCAAAATCAAACCGGAACCAAA-3';actin基因扩增引物对actF:5'-CGAGGCTCCTCTTAACCCAAAGG-3'和actR:5'-CACCAGAATCCAGCACAATACCG-3';NPTII基因扩增引物对nptF:5'-GCTGCCTCGTCCTGGAGTTCATT-3'和nptR:5'-GCACAACAGACAATCGGCTGCTC-3'。以上引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.1.3 酶与试剂Tag酶系TaKaRa公司产品;克隆载体pEASY-T1购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取与纯化 应用常规CTAB方法从叶片中提取基因组DNA。RNase酶处理去除RNA，紫外分光光度计法检测DNA质量和浓度，用无菌水分别稀释成50 ng/μl和100 ng/μl后备用。

1.2.2 T-DNA 插入位点旁侧序列克隆采用TAILPCR方法，具体步骤同文献［17］。

1.2.3 旁侧序列PCR验证 依据旁侧序列设计左侧扩增引物对(LBF1/LBR、LBF2/LBR、LBF3/LBR)和右侧引物对(RBF1/RBR、RBF2/RBR、RBF3/RBR、RBF4/RBR)。以 W-4和 Westar基因组 DNA为模板，PCR扩增特异性条带。反应体系:PCR反应体系20μl，基因组DNA 1μl(50 ng)，缓冲液(含MgCl2)2 μl，dNTPs(2 mmol/L)1.6 μl，LR Tag聚合酶0.5μl，上下游引物10 μmol/L各1μl，补水至20μl。扩增程序:95℃ 变性2 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环后，再72℃下延伸5 min。1%琼脂糖电泳分析扩增产物。

1.2.4 事件特异性检测法 以转基因油菜W-4、T2、T3、A8、B6、R49、R54 和非转基因油菜 Westar的基因组DNA以及无菌水(空白对照)做模板，分别用引物对 TLF/TLR、TRF/TRR、actF/actR、NPTF/NPTR进行 PCR扩增。检验 LBF/LBR、RBF/RBR引物对扩增的特异性。反应体系同方法1.2.3。退火温度依此为58℃、58℃、55℃、56℃。

1.2.5 检测灵敏度试验 用浓度为100 ng/μl非转基因油菜DNA和同样浓度的转基因油菜W-4的基因组 DNA，按照质量百分比配置分别含有100.00%、50.00%、10.00%、5.00%、1.00%、0.50%、0.10%、0.05%、0的转基因油菜W-4的基因组DNA。用事件特异性引物对进行PCR扩增，反应体系同方法1.2.4。1%琼脂糖电泳分析扩增产物。

2 结果

2.1 旁侧序列克隆与分析

图1 左边界旁侧序列Fig.1 Flanking sequence to left border

左边界经3轮TAIL-PCR扩增，获得大小约750 bp的产物，经克隆、测序，并剔除克隆载体序列后，最终获得大小为641 bp的序列。与转化载体pCNFIRnos T-DNA左边界序列比对，结果显示，366～641 bp序列与载体左边界序列高度同源，推测1～365 bp序列为T-DNA的左边界的旁侧序列(图1)，此段油菜基因组序列的碱基组成为G+C含量32.60%、A+T含量为67.40%。右边界经4轮扩增，获得500 bp的产物，经克隆、测序并剔除克隆载体序列后，获得大小为470 bp的序列(图2)，与转化载体 pCNFIRnos T-DNA右边界序列比对，其中1～180 bp与载体序列完全一致，因此推测 181～470 bp序列为T-DNA右边界的旁侧序列，是油菜基因组序列，其碱基组成为G+C含量31.27%、A+T含量为68.73%。W-4的T-DNA左、右边界序列的旁侧序列碱系组成相似，A+T含量均为67.00%左右，表明T-DNA整合在油菜基因组中A/T碱基丰富区。CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCGCATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCC CAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGCCGAGGAGAGCTTTGCTTTGATATT TTGGATATCAGTTTACTTCGGATTGGATGGATGACATCTATATAGGAACTGGCGAATTTTCAGTTCGGATGGGCTCGAATGGTTTTA GATTCGGTAAAACTTGGAATCAGAAATACTTGTAAAATTTGGTTCCGGTTTGATTTTGGTTCGATTATTTTAGGTAATTCAATAAAGT ATAAAATATTTCAGGTAAAATATAGAACGAATAAAATCTTCAACAATTCAAACTATTTGGGATATTTCAGATAGAAATATTATGATAT TT黑体部分为基因组序列;斜体部分为T-DNA序列。

2.2 旁侧序列的验证

根据获得的左、右边界旁侧序列分别设计2条引物(LBF和 RBR)，分别与 LBF1、LBF2、LBF3和RBF1、RBF2、RBF3、RBF4 组成引物对。以转基因油菜基因组DNA为模板，进行PCR扩增。结果左侧扩增产物为800 bp、700 bp和600 bp;右侧扩增产物为 750 bp、650 bp、600 bp、450 bp，与预期产物大小完全一致(图3)。证明所获得的油菜基因组序列与载体左右边界序列相连，是T-DNA插入位点的旁侧序列。

图3 旁侧序列的PCR验证Fig.3 Flanking sequence verification by PCR

2.3 W-4转化事件特异性及灵敏度检测

2.3.1 PCR特异性检测 以转基因油菜W-4、T2、T3、A8、B6、R49、R54 和非转基因油菜 Westar的基因组DNA以及无菌水(空白对照)做模板，用引物对 TLF/TLR、TRF/TRR、actF/actR、nptF/nptR 分别进行PCR扩增。扩增体系正常的情况下actF/actR引物在所有样品中均扩增出152 bp的产物(图4a)。鉴于本试验的转基因油菜均有卡那霉素抗性基因，nptF/nptR引物在除Westar和空白对照外均扩增出预期产物130 bp(图4b);而引物TLF/TLR和TRF/TRR仅在W-4基因组DNA中有扩增产物，预期大小分别为485 bp和405 bp，而在其他转基因油菜、非转基因油菜和空白对照中没有的扩增产物(图4c与图4d)。PCR扩增结果表明，引物对TLF/TLR、TRF/TRR能特异性识别W-4转化事件。

2.3.2 PCR扩增灵敏度检测 以非转基因油菜DNA溶液梯度稀释过的转基因油菜W-4的基因组DNA为模板，分别用左、右两侧事件特异性引物(TLF/TLR、TRF/TRR)进行PCR扩增，左、右两侧引物均能扩增出特异性目标片段。扩增产物的亮度随着稀释度的增加或W-4基因组DNA量的减少而减弱(图5)。灵敏度检测结果显示，引物对TLF/TLR、TRF/TRR在 W-4基因组DNA浓度稀释到0.10%～0.05%时仍能扩增出特异性条带，表明根据W-4左、右边界旁侧序列设计的事件特异性检测引物特异性强、灵敏度高。

3 讨论

T-DNA旁侧序列分析一直是转基因植物研究的热点，对于阐述T-DNA整合方式、染色体定位、转基因表达活性等具有重要意义。通过旁侧序列分析发现:T-DNA右边界序列通常比左边界序列更保守，T-DNA整合过程中左边界序列发生缺失的频率高于右边界序列［18-19］;尽管普遍认为农杆菌介导的转基因相比其他转化方法单拷贝或寡拷贝的整合频率更高，但是在同一染色体位点也常发生多拷贝整合的现象［20］;在一些转基因植物中T-DNA整合位点的选择并非完全随机，T-DNA整合区域多为A/T碱基丰富区;对转基因拟南芥的研究发现T-DNA整合位点与染色体上基因分布的密度相关，T-DNA插入位点倾向于基因间区域，整合在外显子区域和内含子区域的频率没有显著性差异［21］;T-DNA插入位点位于重复区域的频率较低［22］，这可能是选择的结果。有报道称T-DNA左右边界附近的序列与插入位点的旁侧序列有部分同源(Microsimilarity)的现象［23-24］，这可能是 T-DNA整合位点的一种选择机制;T-DNA插入常伴随受体基因组序列的缺失、重排、易位等变化。因此说T-DNA整合过程是个复杂的异常重组过程，还有许多未知问题尚待研究。

图4 不同引物PCR的特异性检测Fig.4 Specificity detection with different primers by PCR

图5 转基因W-4事件特异性PCR灵敏度检测Fig.5 Sensitivity detection for event-specific PCR

本研究通过TAIL-PCR方法分离到转基因油菜W-4基因组中与T-DNA左右边界序列相连的旁侧序列分别为 365 bp和 290 bp，左、右旁侧序列的A+T含量分别为67.40%、68.73%。表明 W-4转基因插入位点位于染色体中A/T丰富区。ATRich是非编码区的典型特征，据此可以推测W-4转基因插入位点可能处于非编码区。进一步将这两段序列分别与芸薹属白菜和甘蓝基因组数据库现有的序列比对，左边界旁侧序列与A08、C08部分序列同源，而右边界则与A09、和C08部分序列同源。由于目前获得的W-4的T-DNA插入位点的旁侧序列片段较小，加上目前已有的芸薹属基因组数据库信息尚不完整，因此根据目前的序列信息还难以对W-4的插入位点进行精确定位。

转基因油菜品系W-4是转基因途径获得的高油酸油菜品系，含一个拷贝的转基因［17］。遗传分析显示W-4的高油酸性状受1对显性单基因控制遗传，且转基因表达稳定［25］。W-4作为一个高油酸新种质，在油菜高油酸育种上的应用前景广阔，但是W-4是转基因材料，在其应用与环境释放前需要对其进行转基因生物安全评价，并需要建立W-4的转基因事件特异性检测技术。

本研究根据W-4左右边界旁侧序列分别设计了2对特异性引物用于定性PCR检测，以油菜actin基因为扩增体系对照，以其他6种含有卡那霉素选择基因的转基因油菜品系为转基因阳性对照，以Westar为转基因阴性对照。试验结果显示，actF/actR引物对在所有油菜的DNA样品中均能扩增到特异性产物，说明扩增体系正常;nptF/nptR引物对除了阴性对照外所有转基因样品中均扩增到产物;引物对LBF/LBF、RBF/RBR仅在W-4中检测到特异性产物，而在其他转基因油菜中没有扩增条带，说明LBF/LBF、RBF/RBR引物对转基因油菜W-4具有高度特异性。PCR灵敏度检测结果显示，应用LBF/LBF、RBF/RBR引物检测灵敏度可以达到0.10% ～0.05%，表明根据品系W-4左、右边界融合序列设计的定性PCR检测体系具有稳定性好、特异性强和灵敏度高的特点，适用于转基因油菜品系W-4的定性检测。

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