家蚕滞育激素受体体外上调下游海藻糖酶基因的表达

沈兴家，王力刚，韦博尤，朱 娟，唐顺明，赵巧玲

(1.江苏科技大学蚕业研究所，江苏镇江212018)

(2.中国农业科学院蚕业研究所，江苏镇江212018)

(3.广西蚕业科学研究院，广西南宁530007)

家蚕是一种重要的经济昆虫和模式生物，家蚕滞育机理研究一直受到学界的关注并取得了重要进展［1－3］.家蚕滞育是由滞育激素(DH)与家蚕滞育激素受体(BmDHR)结合，通过抑制环鸟苷酸(cGMP)的合成，上调下游海藻糖酶基因(Bmtre)的表达，从而促进海藻糖转化成葡萄糖，滞育发生［4－6］.根据生物信息学分析，家蚕滞育激素受体基因有5种剪接方式，即转录成5种mRNA，其中Bmdhr－1与Bmdhr－2编码的氨基酸序列相同，因此共编译4种蛋白质 BmDHR－1，－3，－4，－5［7］.其中，BmDHR－1是一种 G 蛋白偶联受体，能特异性结合滞育激素，偶联Gq蛋白，通过钙离子和蛋白激酶C参与激活下游滞育信号，使家蚕卵巢细胞内的海藻糖酶活性增高［4］.

海藻糖酶(EC3.2.1.28)是昆虫体内重要的糖酶，也是昆虫体内唯一能够水解海藻糖的酶类，它能专一性地将1分子海藻糖水解为2分子的葡萄糖［8］，产生的葡萄糖最终作为昆虫细胞进行生命活动的原料［9－11］.在二化性家蚕中，受滞育信号的影响，蛹体表现出激活卵巢海藻糖酶的表达活性［12］，促进血液中的海藻糖转化［6，13－14］.伴随着滞育的启动，糖原被转化成多元醇，如具有冷冻保护作用的山梨醇和甘油［15］.但是，在分子水平上验证BmDHR对下游海藻糖酶基因(Bmdhr)的调控作用则尚未见报道.文中以pcDNA3.1载体为骨架构建真核表达载体，用家蚕核型多角体病毒的ie－1启动子启动Bmdhr基因的表达［16］，利用家蚕细胞瞬时表达系统，在滞育激素的刺激下体外分析海藻糖酶启动子的活性，验证BmDHR的功能.

1 实验

1.1 材料与主要试剂

家蚕二化性品种“秋丰”，宿主菌E.coli Top10菌株、pcDNA3.0载体、pMD－ie－1质粒(ie－1启动子片段长度为 646 bp，两端分别含 BglⅡ和BamHⅠ限制性酶切位点)［16］、p3Z －Bmtre－luc表达质粒，p3Z －Bmtre质粒［17］，以及包含 Bmdhr基因 cDNA 的各种质粒(pMD18 － Bmdhr)［7］均由本实验室构建并保存.

各种限制性内切酶、ExTaq酶、T4 DNA连接酶、质粒载体pMD18－T和pGL3.0 basic载体等购自宝生物工程(大连)有限公司.TC－100昆虫细胞培养基、胎牛血清(FBS)、Lipofectin试剂购自Invitrogen公司;荧光素酶检测试剂盒(E4030)购自Promega公司.滞育激素(MW:2731.01)由上海强耀生物科技有限公司合成［18］.

1.2 Bmdhr cDNA片段克隆

根据家蚕滞育激素受体基因Bmdhr mRNA－1，mRNA －3，mRNA －4，mRNA －5 序列，分别设计上游引物Bmdhr－F:GGTACCATGAACTCAGAAACAATAAACGA(含BamHⅠ位点);4个下游引物分别为:Bmdhr －1－R AAGCTTGATTGCCATCTGAGTAGC(含 HindⅢ位点，下同)，Bmdhr－3－R AAGCTTGACGGCGGTATCATTG，Bmdhr－4－R AAGCTTATTGATTGCCATCTGAGTAGC，Bmdhr－5－R AAGCTTCCTAAATGTATTGTTTGTAAGC.其合成、测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

分别以各种包含Bmdhr cDNA的质粒pMD18－Bmdhr为模板用上述上、下游引物进行PCR扩增，程序为:95℃ 3 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃45 s，共30个循环;72℃ 7 min.以1%琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司测序.

1.3 表达载体构建

将上述测序正确的各种PCR片段经BamHⅠ－BglⅡ双酶解后，分别连接到经同样双酶解的pMD－ie－1质粒中，在top 10菌株中筛选重组质粒pMD－ie1－Bmdhr;再分别经BamHⅠ－HindⅢ双酶切后，回收酶切产物片段ie－1－Bmdhr，分别连接到经同样 BamHⅠ －HindⅢ双酶切的 pcDNA3.0载体中，构建BmDHR表达载体pcDNA－ie1－Bmdhr，并进行酶切鉴定.

1.4 细胞培养与转染

家蚕细胞BmN参照文献［19］的方法进行细胞培养传代.细胞用24孔板培养24h后用于转染.在100 μL反应体系中，分别用5 μL Lipofectin包埋1 μg表达质粒与p3Z－Bmtre－luc报告质粒制成转染液.转染前倾去旧培养基，用无血清培养基轻洗涤2次，加1 mL无血清TC－100培养基，加入100 μL转染液混匀，温育细胞4～5 h，除去旧培养基，加入1mL含100nmol/L滞育激素浓度和10%FBS的TC－100培养基.以p3Z－Bmtre－luc报告质粒转染的细胞为对照，每组试验重复3次.

1.5 荧光素酶活性分析

细胞转染72 h后，5 000 g 4℃离心5 min收集细胞，去上清液，按照E4030试剂盒(Promega)的说明裂解细胞.加100 μL荧光素酶底物于测定管中，然后加入20 μL的细胞裂解液混匀，在LuminoMeter 20/20荧光光度计上测定荧光素酶(LUC)活性(2 s延迟，10 s读数)，以相对荧光强度单位(relative luminescence unit，RLU)表示［18，20］.平行测定细胞总蛋白浓度，以校正报告质粒的荧光素酶活性值［16］.使用SPSS软件进行差异性分析.

2 结果与分析

2.1 Bmdhr基因cDNA的扩增与表达质粒的构建

家蚕滞育激素受体基因cDNA的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，经测序与报道的基因序列一致，可用于后续研究.

各重组质粒pMD－Bmdhr经M13引物双向测序后，得到的Bmdhr cDNA序列与预期序列一致，Bmdhr－1，－3，－4，－5分别为1311，810，1104和804 bp，表明已得到正确的目的片段，可以进行表达质粒的构建.对构建的表达质粒pcDNA－ie1－Bmdhr－1，－3，－4，－5进行 BamHⅠ －HindⅢ双酶切鉴定，结果正确(图略)，可用于真核表达.

2.2 BmDHR对Bmtre基因启动子活性的影响

将上述构建的表达质粒pcDNA－ie1－Bmdhr1，pcDNA －ie1－Bmdhr3，pcDNA －ie1－Bmdhr4，pcDNA－ie1－Bmdhr5分别与 p3Z－Bmtreluc报告质粒共同转染BmN细胞，以p3Z－Bmtreluc报告质粒转染的细胞为阳性对照，载体p3ZBmtre转染的细胞为空白对照，4～5 h后用含100 nM滞育激素的培养基替换旧培养基.72 h后检测LUC活性，并经空白对照和总蛋白量矫正.结果如图1所示，在100 nM的滞育激素影响下，表达Bm-DHR－1、－3、－4和－5载体共转染分别使海藻糖酶基因启动子的活性提高2.4，2.8，1.7，2.2倍，达到显著水平(F=12.041，P=0.026＜0.05).

2.3 BmDHR－1与BmDHR－5共表达分析

将表达质粒pcDNA－ie－1－Bmdhr－1，pcDNA－ie－1－Bmdhr－5 DNA 按不同摩尔比(0∶4，1∶1，3∶1，1∶3，4∶0)与 p3Z － Bmtre－luc报告质粒共同转染BmN细胞，以p3Z－Bmtre－luc报告质粒转染的细胞为阳性对照，载体p3Z－Bmtre转染的细胞为空白对照，4～5 h后用含100 nM滞育激素的培养基替换旧培养基.72 h后检测LUC活性，并经空白对照和总蛋白量矫正，结果如图2所示.在100 nM的滞育激素作用下，对照组海藻糖酶启动子活性为11 504.33±500.67，图2显示不同摩尔比的 Bmdhr－1/BmDHR －5(1∶1，3∶1，1∶3)分别使海藻糖酶启动子的活性提高3.1，3.5，2.3倍，达到显著水平(F=8.465，P=0.029 ＜0.05).其中，摩尔比为1∶1和3∶1时，海藻糖酶启动子的活性极显著高于BmDHR－1或BmDHR－5单独作用(F=58.951，P=0.001 55 ＜ 0.01;F=107.364，P=0.00049＜0.01;F=29.472，P=0.00558＜0.01;F=60.9872，P=0.00145 ＜0.01);比例为1∶3 时与二者单独作用时相当，差异不显著(以与BmDHR－5单独作用的差异分析为例，F=7.099，P=0.057＞0.05).

图2 不同摩尔比的BmDHR－1/BmDHR－5对海藻糖酶启动子活性的影响Fig.2 Effects of different Mole ratio of BmDHR －1/BmDHR－5 on Bmtre promoter activities

3 结论

文中分别构建了家蚕4个滞育激素受体Bm-DHR－1，－3，－4，－5的表达质粒，利用家蚕细胞瞬时表达系统，体外分析了家蚕不同滞育激素受体或其组合对海藻糖酶基因启动子活性的影响.由于BmDHR必须与DH结合才能调控下游基因的表达［4－6］，因此在家蚕细胞共转染表达质粒和报告质粒后的培养基中加入人工合成的家蚕DH(100 nM).

在滞育激素作用下，Bmdhr－1、－3、－4和 －5分别单独表达时，均上调家蚕Bmtre启动子的活性，证明BmDHR能上调下游基因Bmtre的表达.但是，4种BmDHR对Bmtre上调倍数存在差异，由高到低依次为BmDHR－3、BmDHR－1、BmDHR－5、BmDHR－4，生物信息学分析显示4个BmDHR的一级氨基酸序列同源性很高，前5次跨膜结构完全一致［7］，表明BmDHR调节海藻糖酶启动子的活性部位可能在前5次跨膜区域.

G蛋白偶联受体可以通过组成二聚体发挥作用，其中包括同源二聚体和异源二聚体两种类型［21］.形成二聚体的G蛋白偶联受体在功能上的变化也有不同，有的会增加活性，有的会减弱活性，甚至会导致受体脱敏或发生内吞作用［22］.家蚕滞育激素受体属于G蛋白偶联受体，BmDHR－1和BmDHR－5在蛹期血液中相对表达量很高，而其他几个受体的表达量较低［7］，即 BmDHR－1和BmDHR－5是导致蚕卵滞育的主要受体.因此，本实验选择BmDHR－1与BmDHR－5表达载体在BmN细胞中进行同表达.

不同摩尔比(1∶3，1∶1 和 3∶1)的 BmDHR －1/BmDHR－5表达载体，与p3Z－Bmtre－luc共转染BmN细胞后，荧光素酶活性均呈上调现象，且荧光素酶活性随着BmDHR－5摩尔比的减小，上调倍数逐渐升高.说明BmDHR－1/BmDHR－5共表达上调Bmtre基因的表达;BmDHR－5的过量表达对BmDHR－1的活性有一定的抑制作用.但是当只有BmDHR－1单独表达时，对luc基因上调倍数反而比BmDHR－1/BmDHR－5比例为3∶1时低，这是否由于BmDHR－1大量积累后形成同源二聚体，导致自身脱敏，从而失去受体作用，还需要进一步实验研究.

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