银莲花的抗氧化、抑菌和抗肿瘤活性

李建飞，王俊丽，公维镇，费良丹，刘金豆

（中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081）

银莲花（Anemonecathayensis）为毛茛科（Ranunculaceae）银莲花属（Anemone）植物，在我国分布于山西、河北等地，海拔高度为1 000～1 600m，主要生长于山坡草地、山谷沟边或多石砾坡地.朝鲜也有分布［1］.银莲花属许多植物为中国传统中药材，在民间人们将阿尔泰银莲花、西南银莲花、多被银莲花、鹅掌草、野棉花等作为消炎［2］、镇痛、抗菌［3］、驱虫等药物使用，《中华人民共和国药典》已将多被银莲花的根茎收载，用于祛风湿、消痈肿，同时还可治疗骨节疼痛、痈肿溃烂、风寒湿痹等症［4］.

目前，国内对银莲花属植物的生物活性研究主要集中于银莲花素A抗癌活性的研究［5－10］，对其抗氧化活性和抑菌活性的研究很少.本研究主要通过DPPH法研究银莲花乙醇提取物不同组分的抗氧化活性，通过抑菌圈法探究不同组分对金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大肠杆菌（Esherichiacoli）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）抑菌活性，通过MTT法研究不同组分及分离到的3－氧－2，23－二羟基－齐敦果－12－烯－28－酸等10个不同单体化合物对肿瘤细胞的抑制作用.

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

银莲花植株采自北京灵山海拔2 200m处阳坡.取1.5kg全草干品，经体积分数为95%的乙醇闪式提取，合并减压蒸干得粗提物.组分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ分别是石油醚与丙酮体积比为5∶1，3∶1，2∶1，1∶1时和纯丙酮层经过硅胶柱梯度洗脱所得浸膏.10个单体化合物分别为3－氧－2，23－二羟基－齐敦果－12－烯－28－酸（1），28－羟基－齐敦果－12－烯－3，11－二酮（2），3－甲氧基－齐敦果－11－酮－18－烯（3），熊果酸（4），α－香树脂醇（5），28－羟基－α－香树脂醇（6），2α，23－二羟基－熊果酸（7），香豆素（8），4，7－二甲氧基－5－甲基香豆素（9），槲皮素－7－O－鼠李糖苷（10），其分离方法参见文献［11］.

所用肿瘤细胞为人乳腺肿瘤细胞（MDA－MB－231）；所用菌种分别为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Esherichiacoli）和枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），均由本实验室保藏.

1.2 方法

1.2.1 抗氧化活性测定

参照Kirby和Schmidt方法［12］.200μL反应体系中包含：各种不同待测样品100μL（用体积分数为95%乙醇溶解），60μmol DPPH（SIGMA－ALDRICH，批号：S90790－379）乙醇溶液100μL.于酶标仪（美国Molecular Devices公司）中振动摇匀，暗反应30min后，用酶标仪在517nm下测量吸光度（A）.维生素C作为阳性对照，对照组和处理组都重复3次.自由基清除活性的计算公式如下［13］：抑制率＝［（A对照－A样品）／A对照］×100%.用SPSS17.0版本的相关功能计算其半数抑制浓度

1.2.2 抑菌活性的测定

1.2.2.1 菌悬液制备和培养基的配制

将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌接种培养（37℃的摇床上活化培养24h）后，用无菌生理盐水稀释成含菌量为106～108／mL的菌悬液备用.

在每个直径为90mm的培养皿中加入蛋白胨培养基约10mL，冷凝，再取0.2mL菌悬液加入到10mL 45℃左右的培养基中，充分混合后，倒入上述培养基表面，待其凝固后，用打孔器在培养基上打孔，孔径为6mm.

1.2.2.2 抑菌活性的测定

分别将不同质量浓度的组分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ甲醇溶液各20μL加入到小孔中，于37℃恒温培养箱中培养24h后，观察并测量抑菌圈的直径.以注射用青霉素钠作为阳性对照，以无菌水作为阴性对照.

1.2.3 抗肿瘤活性研究

1.2.3.1 肿瘤细胞的培养

将人乳腺肿瘤细胞（MDA－MB－231）接种于含体积分数为10%的胎牛血清、100u／mL青霉素、100u／mL链霉素双抗RMPI－1640培养基上，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中培养48h.

加入适量培养基，将肿瘤细胞悬液稀释至1×105／mL，接种于96孔培养板，每孔100μL（约含1×104个细胞）.置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中培养12h.

1.2.3.2 抗肿瘤活性检测

实验组各孔分别加入质量浓度为1，500，250，125，62.5μg／mL的不同组分和单体的甲醇溶液各100μL，每个剂量组重复3次；以表阿霉素（辉瑞制药无锡有限公司）作为阳性对照，将其配制成质量浓度为1μg／mL的溶液，每个对照孔加入20μL；以RMPI－1640完全培养基作为阴性对照，每组重复3次.将培养物置于CO2培养箱中培养48h，各培养孔中加入MTT 20μL，再培养4h，弃上清液，每孔加入DMSO 100μL，充分振荡混合10min.通过酶标仪检测吸光度（OD值），检测波长为570nm.为保证实验不被污染，采用0.2μm无菌滤器对各种试剂进行除菌处理.

1.2.3.3 肿瘤细胞抑制率的计算

不同组分和单体化合物对肿瘤细胞抑制率按如下公式计算.抑制率（CI）＝［（空白对照组的OD值－实验组的OD值）／空白对照组的OD值］×100%.

2 结果与分析

2.1 不同组分的抗氧化活性

2.1.1 DPPH自由基清除率

分析发现，各组分均有不同程度的自由基清除活性，且清除率与样品的质量浓度正向相关，在质量浓度为100μg／mL时，组分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ消除率分别为74.9%，43.3%，33.0%，55.1%和22.8%.其中组分Ⅰ的清除率最高（74.9%），组分Ⅴ清除率最低，仅有22.8%（图1）.与阳性对照维生素C（VC）相比，各组分抗氧化活性均低于VC.

图1 5种不同组分对DPPH自由基的消除率Fig.1 DPPH radical scavenging activities of different fractions

表1 5种不同组分的半数抑制质量浓度Tab.1 IC50Value of 5different fractionsμg·mL－1

由表1可知，组分Ⅰ的抗氧化活性最好，对DPPH自由基的半数抑制质量浓度IC50为30.58μg／mL.各组分的IC50值由小到大依次为Ⅰ＜Ⅳ＜Ⅱ＜Ⅲ＜Ⅴ.组分的IC50值越小，表明其抗氧化能力越强，不同组分的抗氧化能力由强到弱依次为Ⅰ＞Ⅳ＞Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅴ.

2.2 抑菌活性

不同质量浓度的5种组分对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果如表2.

表2 5种不同组分的抑菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of 5different fractions

从表2可以看出，组分Ⅴ抑菌活性最强，在质量浓度为40mg／mL时，对大肠杆菌、枯草芽抱杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，当质量浓度降低到10mg／mL时对3种菌仍表现出抑制作用.组分Ⅲ在质量浓度为40mg／mL时对3种菌也表现出明显的抑制作用，在质量浓度为160mg／mL时抑制性最强，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为13mm，大肠杆菌抑菌圈直径12mm，枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为14mm.80mg／mL的组分Ⅳ对枯草芽孢杆菌表现出一定的抑制活性，但对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌没有明显的抑制作用.组分Ⅰ和组分Ⅱ抑菌活性最差，它们对3种菌的抑制作用均不明显.

2.3 抗人乳腺肿瘤细胞活性

2.3.1 5种不同组分对肿瘤细胞的抑制率

通过分析发现，当Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ5种不同组分质量浓度为100μg／mL时，对人乳腺肿瘤细胞（MDAMB－231）抑制率分别为31.79%，50.32%，37.69%，43.65%和29.47%（图2）.表阿霉素对其抑制作用十分明显，虽然加入量很少（20ng），但对肿瘤细胞的抑制率高达69.08%.

由图2可以看出，各个组分对人乳腺肿瘤细胞（MDA－MB－231）均有一定的抑制作用，其抗肿瘤活性从高到低依次为Ⅱ＞Ⅳ＞Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅴ，其中组分Ⅱ的抑制活性最高，达到了50.32%.虽然这5种组分对人乳腺肿瘤细胞均有一定的抑制活性，但是与阳性对照表阿霉素相比，活性明显偏弱.

2.3.2 不同单体化合物对肿瘤细胞的抑制率

研究发现，单体化合物8，9和10对人乳腺肿瘤细胞没有明显抑制作用，化合物1～7均有一定的抗肿瘤细胞活性.当质量浓度为100μg／mL时，这7种单体化合物对肿瘤细胞的抑制率分别达到26.41%，37.80%，33.17%，20.38%，18.31%，16.20%和22.48%，其中化合物2（28－羟基－齐敦果－12－烯－3，11－二酮）对肿瘤细胞的抑制活性最明显（图3）.

图2 5种不同组分对MDA－MB－231肿瘤细胞的抑制率Fig.2 Inhibition activity of different fractions on human breast cancer cells

图3 10种单体化合物对MDA－MB－231肿瘤细胞的抑制率Fig.3 Inhibition activity of different compounds extracted on human breast cancer cells

3 讨论

盛侠［15］研究结果表明，齐墩果酸对DPPH自由基有一定的抑制作用，并且随着齐墩果酸质量浓度的增大，其对自由基的抑制率明显提高，当齐墩果酸为1.0mg／mL时对DPPH自由基的抑制率达到60.86%.本研究发现，组分I的抗氧化活性最高，其中是否为齐墩果酸类化合物起主要作用，需要进一步的研究.

苏波［16］研究毛茛皂苷的抑菌活性时发现，毛茛皂苷对绿脓杆菌、粪肠球菌、产气肠球菌、金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用，而对大肠杆菌、藤黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌、副甲硫杆菌、鸡沙门氏菌5种菌株没有明显的生长抑制性.白宇明［17］发现，金莲花是一种抑菌普很广的中草药，其提取物在体外对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑菌活性.林晨等［18］发现，金莲花不同提取物抑菌效果不同.水提物对金黄色葡萄球菌的MIC为3.0mg／mL，体积分数为60%的乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的MIC是31.3mg／mL，体积分数为60%和90%的乙醇提取物对大肠杆菌的MIC是125.0mg／mL.本研究发现，组分Ⅴ和Ⅲ在质量浓度为80mg／mL时对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均有抑制作用，这进一步说明毛茛科银莲花属植物可作为一种很好的抗菌资源植物.

郑开波等［19］、张东方等［20］研究发现，齐墩果酸对人口腔鳞癌细胞和肺癌细胞具有一定的抑制作用，并且对正常细胞毒性较小.王丹丹等［21］研究结果表明，齐墩果酸及其衍生物对肺癌细胞均有抑制作用，3－氧代齐墩果酸的抑制活性最强，其抑制率高达90.0%，IC50为24.2μg／mL.本研究结果表明，齐墩果酸还对人乳腺肿瘤细胞（MDA－MB－231）具有一定的抑制作用，说明该化合物对肿瘤细胞抑制作用具有广谱性.

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