以稠油为唯一碳源的降解菌株的筛选与评价

李彩风，徐闯，冯云，潘永强，李希明

（胜利油田分公司采油工艺研究院，山东东营 257000）

稠油是全球石油烃类资源中的重要组成部分，约占全球油气资源总量的1／3.中国稠油、沥青资源分布广泛且储量丰富［1－3］.稠油突出的特点是含沥青质、胶质较高，从而导致原油黏度高且在储层中的流动性差，因此难于用常规方法进行开采.鉴于稠油的特点，可以通过降低稠油黏度、减小油流阻力来进行有效的开采，提高采收率.其中微生物降黏技术因具有适应性强、应用范围广、工艺简单、无环境污染等优势成为具有良好发展前景的稠油降黏技术［4－6］.目前的研究主要集中在微生物产生生物表面活性物质、酸、气等代谢产物降低稠油黏度方面的工作［7］.以稠油为唯一碳源稠油降解菌种的筛选，相关研究报道较少［7］.其中，由于缺乏有效、直观的检测手段，降低了大量稠油降解菌种的筛选效率.针对这一情况，本文尝试利用一种新的以稠油为唯一碳源的原油平板，快速选育出能有效降解稠油中胶质和沥青质的菌种，并评价了该菌种对稠油的降黏效果，为现场稠油微生物降黏技术的应用奠定了基础.

1 实验材料

1.1 菌种及原油来源

微生物的样品来源为胜利油田油水井，稠油来自新疆塔河油田.

1.2 实验仪器

生化培养箱，振荡培养箱，超净工作台，双重蒸馏水器，电子分析天平，自动电热压力蒸汽灭菌器，表面张力仪，黏度计，PCR仪.

1.3 培养基

液体培养基（g／L）：Na2HPO410，KH2PO410，FeSO4·7H2O 0.1，NH4NO35，CaCl20.2，pH7.0～7.2，原油20.

原油平板（g／L）：NH4NO31.5，KH2PO41，K2HPO4·3H2O 1，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.2，NaCl 5，琼脂粉20，调pH至7.0～7.2，121℃灭菌20min，取出后倒平板，待平板凝固，加入少量原油，用涂布棒涂布均匀即可.

斜面培养基（g／L）：葡萄糖3，蛋白胨3，酵母粉3，NaCl 5，K2HPO42.7，琼脂粉20，调pH至7.0～7.2，121℃灭菌20min，取出制成斜面.

营养平板（g／L）：葡萄糖3，蛋白胨3，酵母粉3，NaCl 5，K2HPO42.7，琼脂粉20，调pH至7.0～7.2，121℃灭菌20min，然后冷却至45～50℃后注入至已灭菌的培养皿中，待培养基凝固即可.

2 实验方法

2.1 降解菌株的筛选

将胜利油田油水井中分离得到的5株菌接种于以稠油为唯一碳源的原油平板，40℃恒温培养2d，观察各菌株产生扩油圈的情况.只有产生表面活性剂能够乳化碳氢化合物的菌株才能吸收利用原油形成扩油圈，挑选产扩油圈的菌落接种于斜面培养基上作进一步研究.

2.2 菌株鉴定

将筛选的目标菌株进行基因组DNA提取，然后利用细菌16SrDNA测序方法进行菌株分子生物学鉴定.16SrDNA的PCR扩增引物为16SF：AGAGTTTGATCATGGCTCAG（E.coli的16SrDNA对应位置为8～27）和16SR：TACGGTTACCTTGTTACGACTT（E.coli的16SrDNA对应位置为1492～1510），扩增目的片段为1 500bp左右，引物由大连宝生物工程公司合成.100μL PCR反应体系，反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min.将扩增产物进行测序，利用BLAST分析软件与Genebank中的基因序列进行同源性比较.

2.3 原油性质评价

2.3.1 原油黏度测定

在含有稠油的液体培养基中进行接种，40℃恒温振荡培养，同时以不接菌的且含有稠油的液体培养基为空白对照.振荡培养一段时间，去除营养液，加入SLD7007破乳剂脱水，取脱水原油进行原油黏度测试.利用毛细管黏度计在50℃下测定微生物作用前后原油的黏度，并求出其降黏率来显示不同微生物菌液的降黏能力.

2.3.2 原油族组分测试

测试微生物作用前后原油中饱和烃、芳烃、非烃以及沥青质族组分的变化［8］.

2.4 不同时间沥青质降解测试

制备菌悬液接种于在以稠油为唯一碳源的液体营养培养基中，40℃下恒温振荡，将培养10，20，30，40，50d等不同时间的不同菌株作用后的稠油进行沥青质含量的测试.

3 结果与讨论

3.1 降解菌株筛选结果

利用稠油为唯一碳源的原油平板对油田污水中分离得到的能有效利用原油产生物表面活性剂菌株进行稠油降解菌株筛选，图1显示菌株BY和TH能产生明显的扩油圈，说明这2株细菌能够乳化碳氢化合物并吸收利用稠油形成扩油圈.此外，菌株TH重复接种了2次，显示2次产扩油圈直径大致相似，由此可见原油平板检测重复性较好.

3.2 菌株鉴定

将2株细菌的16SrDNA序列与GenBank数据库中的已知序列进行相似性比较，结果表明：菌株TH鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），菌株BY鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）.

3.3 原油乳化能力

将上述筛选出的菌株TH和BY接种于以塔河稠油为唯一碳源的液体培养基中，40℃，160r／min条件下振荡培养5d.如图2所示，2株菌均有较强的原油乳化能力，原油被乳化成小颗粒，培养基颜色均明显变深，而空白对照中原油成块状漂浮在培养基上.显微镜下观察菌株作用后原油乳化情况，从图3可以看出菌株BY作用后的乳化油滴直径在5μm左右，菌株TH作用后的乳化油滴直径在10μm左右.结果表明，两株细菌能以原油为碳源产生生物表面活性剂，促进了原油在水相中的溶解和分散，从而可以改善稠油流动性.

图1 不同菌株原油平板产扩油圈情况Fig.1 Oil spreading of different strains

图2 菌株作用后原油外观变化Fig.2 Appearance change of crude oil under strains

图3 显微镜下菌株作用后原油乳化情况（400x）Fig.3 Microscopic observation of crude oil emulsification under strains

3.4 表面张力变化

研究表明，在烃类化合物的微生物降解过程中，为了使烃类通过外层亲水细胞壁进入细胞被降解酶降解，微生物常产生生物表面活性剂，由于其具有亲水性和亲脂性，从而可促进烃类溶解来解决这一问题［9－10］.从图4中可以看出，空白对照的溶液表面张力为63mN／m左右，而接种微生物的发酵液表面张力显著降低，其中菌株BY的发酵液表面张力降低至35mN／m左右，菌株TH的发酵液表面张力降低至40mN／m左右，再次表明菌株TH和BY在以稠油为唯一碳源的情况下，均不同程度产生了生物表面活性物质，从而导致发酵液的表面张力大大降低.

3.5 原油族组分变化

胶质和沥青质是石油中结构最复杂、分子质量最大的一部分物质，是稠油的主要成分，这正是导致稠油黏度较大的原因［11］.将菌株TH和BY分别接种于斜面，40℃恒温培养2d，然后用无菌水将菌体洗下转移至以稠油为唯一碳源的液体培养基中，40℃，160r／min条件下振荡培养，将作用后的稠油进行族组分分析，结果如表1所示.菌株BY和TH对原油中沥青质的降解效果较好，沥青质质量分数降低率分别为40.7%和32.5%.

图4 发酵液表面张力的变化Fig.4 Surface tension of the fermentation liquid

3.6 原油黏度变化

从表2可以看出稠油经菌株TH和BY作用后，原油黏度均发生了显著降低.其中，菌株TH作用后的原油黏度降低至1 635mPa·s，原油降黏率达53%；菌株BY作用后的原油黏度为1 250mPa·s，降黏率达64%.推测一是微生物对原油具有降解作用，破坏了原油中胶质、沥青质等作为质点形成的网状结构，降低了原油中重质组分的相对含量，从而可以降低原油黏度，与3.5结果一致；二是微生物代谢产生的生物表面活性物质对原油产生了乳化作用，可以降低原油黏度，与3.2结果一致.

表1 不同菌株作用原油族组分分析Tab.1 Composition analyses of crude oil with different strains

表2 不同菌株对原油的降黏作用Tab.2 Viscosity reduction effect of crude oil with different strains

4 结论

1）通过以稠油为唯一碳源的原油平板实验筛选获得2株降解菌BY和TH，分别鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）和蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus），其对稠油的乳化分散效果显著，表明该菌能较好地利用稠油为碳源进行生长繁殖代谢.

2）菌株BY和TH与稠油作用后均能显著降低稠油中沥青质含量、原油黏度和表面张力，表明该菌能降解稠油中的重质组分，并产生了生物表面活性剂等活性物质，降低了原油黏度，从而可改善原油流动性，在稠油开采技术中具有较好的应用前景.

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