siRNA沉默DNA聚合酶β基因表达对食管癌EC9706细胞放疗敏感性的影响

何婷玉+++杜玉文+++陈肖楠+等

[摘要] 目的 探讨siRNA沉默DNA聚合酶β（polβ）基因表达对食管癌EC9706细胞放疗敏感性的影响。 方法 利用脂质体将siRNA转染至EC9706细胞，采用实时荧光定量PCR检测3组不同转染的细胞中polβ mRNA的表达变化；不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）照射3组细胞，CCK8方法检测各组细胞的存活率；用3 Gy照射，流式细胞术检测每组细胞的凋亡率。 结果 转染沉默polβ组polβ基因表达水平显著降低（P<0.01）；CCK8检测结果显示，随着照射剂量的增加，细胞存活率呈下降趋势，其中沉默polβ组细胞存活率显著低于两个对照（P<0.05）；沉默polβ组细胞凋亡率显著高于无关siRNA组或空白对照组（P<0.01），照射后沉默polβ组细胞的凋亡率增加量显著高于无关siRNA组和空白对照组（P<0.01）。 结论 沉默食管癌细胞polβ基因表达可增加其对放疗的敏感性。

[关键词] 聚合酶β；siRNA；食管癌；放疗敏感性

[中图分类号] R735.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）08（c）-0004-04

DNA聚合酶β（DNA polymerase β，polβ）是一种广泛存在于哺乳动物核内的单链小分子蛋白质，属于DNA聚合酶家族中的一员[1]，在DNA合成、损伤及修复中起关键作用[2]，该酶的稳定性较差，催化活性较低，催化反应过程易受多种因素影响，是复制保真度较低的DNA聚合酶[3]，一系列的DNA体外复制实验也证实了polβ基本不参与DNA复制，而可能在DNA损伤修复过程中起一定的作用，如参与碱基切除修复过程（base excision repair，BER）[4]。针对polβ基因的不同特性，国内外不同学者对其进行了不同的研究，其中有结果显示，polβ在射线、烷化剂等诱导的DNA单链断裂（single strand break，SSB）修复中起重要作用[5]，也有研究显示，在肿瘤放射治疗过程中，polβ作为重要修复因子调控着肿瘤细胞对放疗的敏感性。本课题组前期研究中发现，polβ在食管癌组织中高表达，本研究进一步探讨了沉默polβ基因的表达对食管癌细胞株放疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人食管癌细胞EC9706（郑州大学基础医学院保存），胎牛血清、1640培养基、胰蛋白酶（均购置于美国Gibco公司），RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂和Taq DNA聚合酶（加拿大Fermentas 公司）。polβ引物、GAPDH引物（上海生工技术有限公司）。

1.2 siRNA的设计与合成

参考GenBank中polβ基因的编码序列（NM_002 690），使用网上设计软件（www.dharmacon.com）设计出siRNA、siRNA-polβ和siRNA-scramble，具体序列分别为：5′-GAACGTGAGCCAAGCTATC-3′和5′-GAGTAACCGATAGCGCATC-3′，由Ambion公司合成。

1.3 细胞培养和转染

于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中，用含10%胎牛血清、双抗（1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素）的1640培养基培养EC9706细胞，细胞贴满培养瓶瓶底约75%时可传代培养。实验选择对数生长期细胞。将收集的细胞悬液接种于六孔板，每孔5×104个细胞，给予新鲜完全培养基培养至细胞融合度接近50%～80%时进行转染。脂质体转染依据Lipofectamine 2000使用说明进行，实验分为3组：沉默polβ组、无关siRNA对照组、空白对照组。转染后细胞饥饿24 h进行后续实验。

1.4 X线照射

VARIAN直线加速器6 MV-X射线照射，剂量率为2 Gy/min，源皮距100 cm，照射野10 cm×10 cm，培养板下置1 cm等效组织填充物。

1.5 RT-PCR检测 polβ mRNA的表达

收集3组细胞，分别提取总RNA（Invitrogen），Nanadrop 2000荧光分光光度计测定RNA样品的浓度和纯度。应用First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒以Oligo dT为引物逆转录合成cDNA。PCR采用TaqMan方法检测polβ mRNA表达，Primer Premier 5.0软件设计引物，polβ上游5′-GTGCAGAGTCCAG-TGGTGACA-3′；polβ下游5′-CAGTTTTGGCTGTTTGGTTGATT-3′；探针序列：5′-FAM-ATGTTCTCCTGACCCATCCCAGCTTCAC-TAMMR-3′。内参β-actin引物：上游5′-TTCACTTCTTCAGTTCTGCCATCT-3′；下游5′-CCAAGCTTTTCTCAGTCCCATAA-3′；探针序列：5′-FAM-TCAAAGGGCTCCAGCCTCACTCAGTC-TAMMR-3′。PCR反应条件：50℃ 2 min、95℃ 2 min、95℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，45个循环。2-ΔΔCt法分析样品中目的基因的相对表达率。

1.6 CCK8检测EC9706细胞的放射敏感性

细胞增殖测定采用细胞计数试剂盒8（Dojindo，Gaithersburg，MD）根据其说明书进行操作。分别取转染后呈对数生长的3组细胞，采用不同剂量（0、2、4、6、8 Gy）X线照射，PBS清洗，胰酶消化，PBS洗涤后混悬细胞，调整细胞浓度为5×103个/μl转入96孔板中，每组设6个复孔，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中，连续培养2 d，在最后4 h加每孔10 μl CCK8溶液。继续培养4 h后，于分光光度计450 nm波长处测量吸光值，根据吸光值推测出不同处理组的活细胞数目，计算细胞存活率。

1.7 流式细胞仪检测EC9706细胞凋亡

细胞凋亡检测使用Annexin V-FICT/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（Abcam），根据其说明书进行操作。取转染后呈对数生长的3组细胞，每组细胞分2个小组，一小组采用3 Gy X线照射，另一个小组作为对照，胰酶消化，PBS洗涤后混悬细胞，调整每管细胞浓度为1×106个/ml，依次加入Annexin V-FICT和碘化丙啶（PI）试剂，室温，避光15 min后，即采用流式细胞仪检测（Becton Dickinson）。

1.8 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，各组参数的比较用One-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测转染后polβ mRNA的相对表达量

收集转染后各组细胞，提取总RNA，采用实时定量RT-PCR的方法，对各处理组polβ mRNA表达水平进行检测，发现沉默polβ组polβ mRNA相对表达量与无关siRNA对照组、空白对照组比较均显著降低（P<0.01），无关siRNA对照组、空白对照组比较差异无统计学意义（P=0.913）2.2 CCK8法检测细胞放射敏感性的结果

采用CCK8法检测各处理组细胞的存活率发现，随着照射剂量的增加，细胞存活率呈下降趋势，其中沉默polβ组下降趋势较显著，且在不同剂量照射时均与无关siRNA对照组、空白对照组差异有统计学意义（P<0.05），无关siRNA组与空白对照组间差异无统计学意义（P>0.05）2.3 流式细胞术检测细胞凋亡的结果

沉默polβ组（凋亡率为7.3%）较无关siRNA组（3.8%）或空白对照组（3.2%）细胞凋亡增加，差异有统计学意义（P<0.05），而沉默polβ转染联合照射组（17.8%）与沉默polβ组、无关siRNA组、空白对照组或无关siRNA转染联合照射组（11.2%）、空白组联合照射组（10.6%）比较，细胞凋亡增加更为明显，差异有统计学意义（P<0.01），提示沉默polβ可以诱导EC9706细胞的凋亡，且可增加细胞对放疗的敏感性。

3 讨论

食管癌是全球最常见的六大恶性肿瘤之一，全世界每年约有30万人死于食管癌。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人，居恶性肿瘤的第4位。食管癌患者的预后较差，多数食管癌患者在确诊时已发生局部侵袭或远处转移，手术往往难以进行，而只能选择姑息性治疗，放射治疗是食管癌主要的姑息性治疗方法之一，但放疗后的临床疗效却不尽人意，5年生存率仅为10%～30%，肿瘤局部未控率和复发率高达60%～80%[6]。提高食管癌放疗的疗效是目前研究者关注的热点。近年来国内外的研究发现，多种基因及其表达产物，如细胞周期调控基因[7]、凋亡基因[8-9]、DNA损伤修复蛋白[10-11]等，影响肿瘤放射敏感性。DNA损伤修复系统存在于所有细胞中，且在肿瘤细胞中已被证实是抵抗放疗或导致肿瘤细胞对放疗不敏感的重要机制之一，作为DNA损伤修复系统中重要的一员，polβ调控肿瘤细胞的放射治疗敏感性是国内外研究的热点。

RNA干扰是内源性或外源性双链RNA诱发的mRNA水平上的基因沉默机制，小片段干扰性RNA通过序列特异性的降解作用，能有效封闭靶mRNA和降低蛋白水平[12]。RNAi技术的发展日趋成熟，凭借其高稳定性、高效性、高特异性、可遗传性、可扩散性等特点，该技术已经成为一种基因功能研究的重要工具[13]。Bentley等[14]发现，采用RNAi技术可以显著抑制膀胱癌细胞的侵袭能力；另有研究发现，运用RNAi技术下调相应靶蛋白表达后，细胞的放疗敏感性显著增强[15-16]。

基于以上研究背景，本课题组在前期研究中发现，polβ在食管癌组织中高表达的基础上，选择沉默polβ基因转染食管癌细胞，探讨其对食管癌细胞株放射治疗敏感性的影响。通过RT-PCR技术证实了siRNA-polβ明显抑制了polβ基因的表达，采用CCK8方法检测到沉默polβ组的食管癌细胞对放射治疗的敏感性较无关siRNA组、空白对照组有明显增高的趋势，流式细胞术检测各处理组细胞的凋亡情况进一步显示，polβ基因沉默增加了食管癌细胞株的放射治疗敏感性，这在一定程度上增加了对polβ基因在DNA修复中作用的规律和机制的认识，也预示了RNA干扰技术在未来食管癌及其他肿瘤的基因治疗方面将具有重要的应用价值。

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（收稿日期：2014-06-18 本文编辑：林利利）

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（收稿日期：2014-06-18 本文编辑：林利利）

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（收稿日期：2014-06-18 本文编辑：林利利）