我国北部湾部分海产品中副溶血弧菌的基因分型研究

韦强+李毅财

摘要利用RAPD技术对北部湾分离的24株Vp进行基因分型。结果显示：RAPD可以分离出7~11条不同的条带，大小0.45~1.50 kb。聚类分析结果表明在相似度为0.84时，RAPD分辨力指数为0.931。采用通过POPGENE 32软件对比了24株Vp的各种遗传参数，结果表明：RAPD的Shannon信息指数、有效等位基因数、Nei基因多样性分别为0.561 6、1.681 6和0.382 3。表明RAPD能较好地研究Vp的分子遗传特征，适合于区分不同来源的Vp菌株。

关键词海产品；副溶血弧菌；基因分型；RAPD；聚类分析；北部湾

中图分类号Q789文献标识码A文章编号 1007-5739（2014）11-0273-02

ResearchonGenotypingofVibrioparahaemolyticusinSeafoodinPartofChineseBeibuGulf

WEI Qiang 1LI Yi-cai 2

（1 Luobu Town Yufeng District Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Station of Liuzhou City in Guangxi Zhuang Autonomous Region 545011；

2 Laibin Animal Product Quality and Safety Testing Center）

AbstractGenotyping 24 strains of Vp from Beibu Gulf were conducted using RAPD. The results showed that RAPD yielded 7 to 11 distinct bands with the size range between 0.45 kb and 1.50 kb. Cluster analysis showed that with the coefficient more than 0.84，RAPD resolution index was 0.931. Using POPGENE 32 software compared to the parameters of various genetic 24 strains of Vp，results showed that the Shannon information index（I），effective number of alleles per locus（Ne），Nei′s gene diversity index（H）of RAPD were 0.561 6，1.681 6 and 0.382 3，respectively. The results showed that the RAPD method was sensitive to distinguish reflect the molecular genetic characteristics Vp strains.

Key wordsseafood；Vibrio parahaemolyticus；genotype；RAPD；clustering analysis；Beibu Gulf

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）的传统分型方法是血清分型，主要是利用菌体的O抗原和荚膜的K抗原对细菌进行区分。但是该方法也存在不少缺点：分辨力有限，且人为因素干扰严重，尤其在突发公共卫生事件需要病原进行溯源时难以满足准确、快速追踪的需求。随着分子生物学技术的发展，基因分型技术已越来越广泛的应用于病源微生物的检测和流行病学的研究中。用分子分型技术从分子水平上研究Vp的变化情况，能更好地了解不同地区Vp之间的亲缘关系以及遗传关系变化情况，也有利于追踪Vp感染的源头，从而更好地预防和控制Vp引起的食物中毒等事件的发生[1]。

通过从我国北部湾4个海区不同采样点采集的不同贝类样品中分离的Vp，利用RAPD方法，分析了不同来源菌株间的种类、遗传参数，比较了Vp菌株的指纹图谱的相似度，以便了解不同地区贝类产品中不同菌株的遗传变异程度和考察菌株间的差异和地理来源的关系。以此为基础探讨RAPD分型技术的优缺点，为深入了解Vp的分子生物学特征提供技术参考。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株来源。分别从我国北部湾湛江港、防城港，钦州港和北海港采集贝类样品（牡蛎、扇贝、菲律宾蛤仔、毛蚶、贻贝、缢蛏），并分离菌株，采用MPN-PCR[2]方法检测，确定为Vp菌株，共从中挑选出的24株，菌株的来源（表1）。

1.1.2试剂。TaqDNA聚合酶，10×Buffer，2.5 mmol/L dNTPs，DNA Maker，6×Loading Buffer购自TAKARA公司；Gene Finder核酸染料，购自厦门百维信生物科技有限公司；RAPD引物序列为：5′-CAGGCGCACA-3′，均由华大基因合成。

1.2试验方法

1.2.1副溶血弧菌基因组DNA的提取。参照文献[3]和《精编分子生物学实验指南》的CTAB法提取副溶血弧菌分离株基因组DNA。

1.2.2RAPD反应体系及反应参数。RAPD的反应体系（表2），PCR反应程序如下：94 ℃预变性5 min，后45个循环每个循环包括（94 ℃变性，1 min，36 ℃连接1 min 30 s，72 ℃延伸2 min 30 s），最后72 ℃延伸10 min。扩增产物与Gene Finder核酸染料混合后，经1.5%的琼脂糖点样，90 V电泳120 min，凝胶成像系统成像并拍照。

1.3数据处理

DNA指纹分析的结果是二元性状的图，即在同一位置上的带属于同一个位点，有带的记为1，无带的记为0。所得的位点按分子量从大到小排列。应用POPGENE 32软件对28个个体进行遗传参数计算。其中有：①反映基因多少和状况的遗传参数：观测等位基因数（Na，Observed number of alleles）和有效等位基因数（Ne，Effective number of alleles）（Kimura and Crow，1964）；②反映基因多样性信息的遗传参数，Nei基因多样性（H，Nei′s gene diversity）和Shannon信息指数（I，Shannon′s Information index，Lewontin 1972）。

数据用NTSYS pc2.10e软件计算遗传相似系数，并选定UPGMA（Unweighted pair group method using arithmetic average，非加权配对算术平均法）聚类方法，自动生成聚类图。分辨力指数（D）按以下公式进行计算：

D=1-■■nj（nj-1）

其中N为样本数，s为能区分的类型数，nj为属于j类型的样本数量。

2结果与分析

2.1RAPD电泳图谱分析

电泳结果如图1所示，表明RAPD扩增的条带在450~1 500 bp，扩增的条带为7~11条，条带清晰明亮，多态性高。

2.2RAPD遗传参数分析

POPGENE 32软件对24株菌进行分析结果如表3所示，结果表明：Shannon信息指数（Ⅰ）为0.561 6，说明各个菌株间个体分配的均匀性差异较大；等位基因观察数（Na）为2.000；有效等位基因数（Ne）为1.681 6；Nei′s基因多样性指数（H）为0.382 3。Nei′s基因多样性指数相对较高达到0.382 3，说明Vp群体间交流频繁，产生了遗传多样性。

2.3RAPD聚类分析

根据RAPD电泳图谱，用NTSYS pc2.10e软件对24株菌的遗传关系进行聚类分析（图2）。从遗传相似性系数可知，Vp种间相似性系数变化较大。聚类结果表明，在0.84相似度时，24株菌可分成16个群，分辨力指数为0.931。

3讨论

3.1RAPD优缺点

RAPD技术由于操作简便、试验成本低，可以通过未知的DNA模板序列信息的条件下，采用几个较短的随机引物通过PCR扩增基因组DNA模板的任意部分，从而可以对整个群落进行描绘等独特的优点倍受重视，并已被广泛应用于生物遗传多样性的研究[4]。但是RAPD技术缺点表现在易受外界因素影响，重复性较差。而且由于RAPD对于由几个相同碱基组成的序列不能区分出来，因此对物种的相似性估计有偏大的趋势，这个是RAPD的最大不足之处。

3.2Vp分型方法比较

试验中采用RAPD技术对24株Vp分型进行结果因此RAPD技术比较适合对大规模的Vp的分型研究。根据RAPD展现出Vp不同菌株间多态性，比较其遗传相似度后发现：不同地点采集的Vp具有丰富的遗传多样性。有些表现出遗传相似度较高，表明他们具有更近的亲缘关系，同时也表明，菌株的遗传相似性与地理位置、宿主等有一定的相关性。这个结论与苏婷等[5]采用DGGE技术调查广州南海海区Vp的多态性结果类似。

RAPD产生的条带明亮、清晰，方法操作简单，成本低廉，便于快速检验，因此就本次研究来说RAPD比较适合对Vp菌株进行分型。DGGE技术具有良好的分辨率，可以达到1个碱基差异的水平，因此要是RAPD能结合DGGE技术，就能各自发挥各自的优点。Bahieldin等[6]在2006年采用RAPD-DGGE技术研究4种大麦时，发现该技术组合能克服RAPD在应用于植物的遗传分析试验，例如低水平的重复性和多态性，同时具有高的结果重现性，更高水平的多态性，因此是一种相互结合的良好的DNA分析技术。

4参考文献

[1] 钟凯.副溶血弧菌的快速检验与应用[J].中国预防医学杂志，2005，6（1）：75-78.

[2] 曹慧慧.国内主要沿海城市零售贝类中副溶血性弧菌的定量风险评估[D].青岛：中国海洋大学，2010.

[3] YANG Z Q，JIAO X A，ZHOU X H，et al.Isolation and molecu-lar characterization of Vibrio parahaemolyticus from fresh，low- temperature preserved，dried，and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J].International Journal of Food Microbiology，2008，25（3）：279-285.

[4] 张俊彦，梅玲玲，朱敏，等.301份海水产品副溶血性弧菌定量检测分析[J].中国卫生检验杂志，2007，17（3）：509-510.

[5] 苏婷，罗鹏.34株副溶血弧菌16S-23SrDNA间区多态性DGGE分析[J].热带海洋学报，2010，3（29）：55-60.

[6] BAHIELDIN A，AHMED I A，GADELKARIM G A.DGGE-RAPD analysis as a useful tool for cultivar identification[J].African Journal of Biotechno-logy，2006，5（8）：566-569.

2.1RAPD电泳图谱分析

电泳结果如图1所示，表明RAPD扩增的条带在450~1 500 bp，扩增的条带为7~11条，条带清晰明亮，多态性高。

2.2RAPD遗传参数分析

POPGENE 32软件对24株菌进行分析结果如表3所示，结果表明：Shannon信息指数（Ⅰ）为0.561 6，说明各个菌株间个体分配的均匀性差异较大；等位基因观察数（Na）为2.000；有效等位基因数（Ne）为1.681 6；Nei′s基因多样性指数（H）为0.382 3。Nei′s基因多样性指数相对较高达到0.382 3，说明Vp群体间交流频繁，产生了遗传多样性。

2.3RAPD聚类分析

根据RAPD电泳图谱，用NTSYS pc2.10e软件对24株菌的遗传关系进行聚类分析（图2）。从遗传相似性系数可知，Vp种间相似性系数变化较大。聚类结果表明，在0.84相似度时，24株菌可分成16个群，分辨力指数为0.931。

3讨论

3.1RAPD优缺点

RAPD技术由于操作简便、试验成本低，可以通过未知的DNA模板序列信息的条件下，采用几个较短的随机引物通过PCR扩增基因组DNA模板的任意部分，从而可以对整个群落进行描绘等独特的优点倍受重视，并已被广泛应用于生物遗传多样性的研究[4]。但是RAPD技术缺点表现在易受外界因素影响，重复性较差。而且由于RAPD对于由几个相同碱基组成的序列不能区分出来，因此对物种的相似性估计有偏大的趋势，这个是RAPD的最大不足之处。

3.2Vp分型方法比较

试验中采用RAPD技术对24株Vp分型进行结果因此RAPD技术比较适合对大规模的Vp的分型研究。根据RAPD展现出Vp不同菌株间多态性，比较其遗传相似度后发现：不同地点采集的Vp具有丰富的遗传多样性。有些表现出遗传相似度较高，表明他们具有更近的亲缘关系，同时也表明，菌株的遗传相似性与地理位置、宿主等有一定的相关性。这个结论与苏婷等[5]采用DGGE技术调查广州南海海区Vp的多态性结果类似。

RAPD产生的条带明亮、清晰，方法操作简单，成本低廉，便于快速检验，因此就本次研究来说RAPD比较适合对Vp菌株进行分型。DGGE技术具有良好的分辨率，可以达到1个碱基差异的水平，因此要是RAPD能结合DGGE技术，就能各自发挥各自的优点。Bahieldin等[6]在2006年采用RAPD-DGGE技术研究4种大麦时，发现该技术组合能克服RAPD在应用于植物的遗传分析试验，例如低水平的重复性和多态性，同时具有高的结果重现性，更高水平的多态性，因此是一种相互结合的良好的DNA分析技术。

4参考文献

[1] 钟凯.副溶血弧菌的快速检验与应用[J].中国预防医学杂志，2005，6（1）：75-78.

[2] 曹慧慧.国内主要沿海城市零售贝类中副溶血性弧菌的定量风险评估[D].青岛：中国海洋大学，2010.

[3] YANG Z Q，JIAO X A，ZHOU X H，et al.Isolation and molecu-lar characterization of Vibrio parahaemolyticus from fresh，low- temperature preserved，dried，and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J].International Journal of Food Microbiology，2008，25（3）：279-285.

[4] 张俊彦，梅玲玲，朱敏，等.301份海水产品副溶血性弧菌定量检测分析[J].中国卫生检验杂志，2007，17（3）：509-510.

[5] 苏婷，罗鹏.34株副溶血弧菌16S-23SrDNA间区多态性DGGE分析[J].热带海洋学报，2010，3（29）：55-60.

[6] BAHIELDIN A，AHMED I A，GADELKARIM G A.DGGE-RAPD analysis as a useful tool for cultivar identification[J].African Journal of Biotechno-logy，2006，5（8）：566-569.

2.1RAPD电泳图谱分析

电泳结果如图1所示，表明RAPD扩增的条带在450~1 500 bp，扩增的条带为7~11条，条带清晰明亮，多态性高。

2.2RAPD遗传参数分析

POPGENE 32软件对24株菌进行分析结果如表3所示，结果表明：Shannon信息指数（Ⅰ）为0.561 6，说明各个菌株间个体分配的均匀性差异较大；等位基因观察数（Na）为2.000；有效等位基因数（Ne）为1.681 6；Nei′s基因多样性指数（H）为0.382 3。Nei′s基因多样性指数相对较高达到0.382 3，说明Vp群体间交流频繁，产生了遗传多样性。

2.3RAPD聚类分析

根据RAPD电泳图谱，用NTSYS pc2.10e软件对24株菌的遗传关系进行聚类分析（图2）。从遗传相似性系数可知，Vp种间相似性系数变化较大。聚类结果表明，在0.84相似度时，24株菌可分成16个群，分辨力指数为0.931。

3讨论

3.1RAPD优缺点

RAPD技术由于操作简便、试验成本低，可以通过未知的DNA模板序列信息的条件下，采用几个较短的随机引物通过PCR扩增基因组DNA模板的任意部分，从而可以对整个群落进行描绘等独特的优点倍受重视，并已被广泛应用于生物遗传多样性的研究[4]。但是RAPD技术缺点表现在易受外界因素影响，重复性较差。而且由于RAPD对于由几个相同碱基组成的序列不能区分出来，因此对物种的相似性估计有偏大的趋势，这个是RAPD的最大不足之处。

3.2Vp分型方法比较

试验中采用RAPD技术对24株Vp分型进行结果因此RAPD技术比较适合对大规模的Vp的分型研究。根据RAPD展现出Vp不同菌株间多态性，比较其遗传相似度后发现：不同地点采集的Vp具有丰富的遗传多样性。有些表现出遗传相似度较高，表明他们具有更近的亲缘关系，同时也表明，菌株的遗传相似性与地理位置、宿主等有一定的相关性。这个结论与苏婷等[5]采用DGGE技术调查广州南海海区Vp的多态性结果类似。

RAPD产生的条带明亮、清晰，方法操作简单，成本低廉，便于快速检验，因此就本次研究来说RAPD比较适合对Vp菌株进行分型。DGGE技术具有良好的分辨率，可以达到1个碱基差异的水平，因此要是RAPD能结合DGGE技术，就能各自发挥各自的优点。Bahieldin等[6]在2006年采用RAPD-DGGE技术研究4种大麦时，发现该技术组合能克服RAPD在应用于植物的遗传分析试验，例如低水平的重复性和多态性，同时具有高的结果重现性，更高水平的多态性，因此是一种相互结合的良好的DNA分析技术。

4参考文献

[1] 钟凯.副溶血弧菌的快速检验与应用[J].中国预防医学杂志，2005，6（1）：75-78.

[2] 曹慧慧.国内主要沿海城市零售贝类中副溶血性弧菌的定量风险评估[D].青岛：中国海洋大学，2010.

[3] YANG Z Q，JIAO X A，ZHOU X H，et al.Isolation and molecu-lar characterization of Vibrio parahaemolyticus from fresh，low- temperature preserved，dried，and salted seafood products in two coastal areas of eastern China[J].International Journal of Food Microbiology，2008，25（3）：279-285.

[4] 张俊彦，梅玲玲，朱敏，等.301份海水产品副溶血性弧菌定量检测分析[J].中国卫生检验杂志，2007，17（3）：509-510.

[5] 苏婷，罗鹏.34株副溶血弧菌16S-23SrDNA间区多态性DGGE分析[J].热带海洋学报，2010，3（29）：55-60.

[6] BAHIELDIN A，AHMED I A，GADELKARIM G A.DGGE-RAPD analysis as a useful tool for cultivar identification[J].African Journal of Biotechno-logy，2006，5（8）：566-569.