甜菜雄性不育系及保持系花期蛋白差异分析

程大友，崔 杰，牛 佳，代翠红，白 晨

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，150090哈尔滨;2.内蒙古自治区农牧业科学院甜菜研究所，010031呼和浩特)

目前利用作物的雄性不育特性生产杂交种已成为异交作物种子生产的主流.研究作物雄性不育分子机理已成为分子育种的研究热点［1］.随着蛋白质组学技术的发展，蛋白质组分析已应用于拟南芥、水稻和西红柿［2-4］等植物的研究中.在成熟的花粉中大量的蛋白已被鉴定出来.通过对水稻花药小孢子时期的蛋白质组分析，揭示了富含甘氨酸蛋白、热激蛋白、翻译控制蛋白和一些管家蛋白以及在小孢子发育过程中的潜在因子［5］.在拟南芥雄性不育突变体中，孢子发育时腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)活性的丧失被认为是导致不育的原因［6］;水稻的花药中，低温胁迫也能引起雄性不育，这与热激蛋白和β-拓展蛋白的部分阻断有关［7］，在大豆的雄性不育系 NJCMS1A及其保持系中鉴定出了一些在乙烯合成、细胞程序性死亡、ATP合成、淀粉合成过程中起关键作用的蛋白，推测细胞质雄性不育可能是因为这些过程中某蛋白缺失或功能改变，造成这些程序紊乱，进而导致雄性不育［8］;在红莲型水稻的CMS花药中发现缺少与乙酰辅酶A合成有关的酶(乙酰辅酶A合成酶和二氢硫辛酸脱氢酶)，导致三羧酸循环(TCA)和脂肪酸代谢不能正常进行，影响呼吸和能量代谢，最终导致细胞质雄性不育［9］.此外，研究发现水稻、小麦、番茄等雄性不育还与光合作用过程中的一些酶有关，如叶绿体氧增强蛋白1(chloroplast oxygen-evolving enhancer protein 1)和 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)［10-12］.因此，推测雄性不育可能与光合酶系的功能缺陷有关.甜菜在育性相关蛋白方面的报道较少，Masayuki P等在甜菜雄性不育I-12CMS(3)细胞质中找到一个12 KD的蛋白，该蛋白是只在不育系中出现的orf129的蛋白产物;Atp6的5＇前导序列preSatp6只在CMS型线粒体中表达一种35 KD的蛋白［13-14］，推测这两个蛋白可能与雄性不育有关，但是并没有进行进一步的研究.

本文利用2-DE与MALDI-TOF-MS方法对甜菜质核互作型雄性不育系及保持系花蕾发育的3个阶段蛋白差异表达进行研究，以期揭示Owen型甜菜不育系与保持系花蕾不同发育时期蛋白表达的差异.

1 实 验

1.1 实验材料

所用材料来自哈尔滨工业大学自育的甜菜不育系DY5-CMS及其保持系DY5-O.经过春化处理的甜菜母根，于4月20日种植在哈尔滨工业大学甜菜育种试验田，6月25日～7月15日期间进行甜菜花期取样调查.甜菜花蕾发育分成3个时期:雄蕊原基分化期、四分体时期及单核时期.

1.2 实验方法

1.2.1 甜菜花蕾蛋白的提取

采用TCA-丙酮沉淀法提取蛋白［15］，将浓缩后的蛋白干粉置于-20℃保存备用.取13 mg浓缩后的蛋白干粉，加入150 μL蛋白裂解液反复冻融使其复融，采用Brandford法测定蛋白含量，标准蛋白为牛血清白蛋白(BSA).

1.2.2 双向凝胶电泳

第一向等电聚焦电泳参照Bio-Rad公司等电聚焦系统说明书进行;第二向电泳参照文献［15］方法进行.

1.2.3 MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析

经脱色清洗后，将凝胶扫描采集图像利用Image Master 2D Platinum 5.0软件(GE公司)分析蛋白质图谱.经点探测、匹配，找出差异点.将3次重复均出现且特征明显(含量差值大于2.0以上的)的差异蛋白点回收后委托广州慧晶生物科技有限公司进行MALDI-TOF-TOF/MS质谱分析.

2 结果与分析

2.1 雄蕊原基分化期

对甜菜雄蕊原基分化期花蕾蛋白的差异进行分析，在不育系中检测到蛋白点405个，保持系中检测到325个(如图1)，检测出的差异蛋白总数在不育系中升高的有14个点，在保持系中升高的有8个点.

图1 不育系DY5-CMS及其保持系DY5-O的1期花蕾蛋白2DE图谱

利用PMF分析获得质谱图(见图2、3)，去除假阳性点后，鉴定出6种蛋白(见表1)，即NADH脱氢酶、二硫辛酰胺脱氢酶、可溶性无机焦磷酸酶、ATP合成酶的β亚基和ATP合成酶D链、葡萄糖调节蛋白同系物.

图2 双向电泳图谱中蛋白点B05的肽质量指纹图

图3 B05胰蛋白酶酶解后肽段NQⅠDEⅠVLVGGSTR的MS/MS质谱图

表1 DY5-CMS和DY5-O 1期差异蛋白的PMF数据库搜索鉴定结果

2.2 四分体时期

对甜菜四分体时期花蕾蛋白的差异进行分析，在不育系中检测到蛋白点385个，保持系中检测到306个(如图4)，检测出2.0倍表达量以上的差异蛋白在DY5-O中有5个点表达上调，在DY5-CMS中有11个点表达上调.利用MALDITOF-MS分析去除假阳性点后，鉴定出4个蛋白.且这4个蛋白均在不育系中表达上调(见表2).

图4 不育系DY5-CMS及其保持系DY5-O的2期花蕾蛋白2DE图谱

表2 DY5-CMS和DY5-O 2期差异蛋白的PMF数据库搜索鉴定结果

2.3 单核期

对甜菜单核时期花蕾蛋白的差异进行分析，在不育系中检测到蛋白点460个，保持系中检测到508个，检测出2.0倍表达量以上的差异蛋白总数:从3期中找到24个差异点，其中在DY5-O中有16个点表达上调，在DY5-CMS中有8个点表达上调.利用MALDI-TOF-MS分析去除假阳性点后，鉴定出6个蛋白(见表3).

表3 DY5-CMS和DY5-O 3期差异蛋白的PMF数据库搜索鉴定结果

3 讨论

3.1 雄蕊原基分化期花蕾育性蛋白差异分析

从甜菜不育系及保持系1期花蕾蛋白中鉴定出6个差异蛋白，其中不育系中有NADH脱氢酶、二硫辛酰胺脱氢酶、可溶性无机焦磷酸酶、ATP合成酶的β亚基及ATP合成酶的D链5个蛋白表达上调，这5个蛋白均与呼吸和能量代谢有关.在保持系中只检测出葡萄糖调节蛋白78表达上调.

NADH脱氢酶是线粒体呼吸链的重要组成部分，在糖酵解、糖异生、三羧酸循环中起着重要作用.ATP合成酶是高等植物细胞内最大的酶系之一，可以合成ATP为代谢活动提供能量.本实验发现的5种与能量代谢有关的蛋白均在不育系中表达上调，推测ATP合成酶被水解导致能量供应不足，促使雄性不育系植物中与能量代谢有关酶的表达量上调.因此，推测这些与呼吸及能量代谢有关的蛋白与甜菜的细胞质雄性不育有关.

葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是内质网上一种重要的分子伴侣，能阻止内质网内新生肽聚集，并辅助内质网中新生肽形成正确构象;GRP78还是一种钙结合蛋白，维持内质网钙稳态及内环境的稳态.本实验只在甜菜的保持系DY5-O中发现了该蛋白，而在不育系DY5-CMS中没有发现，推测在不育系中该酶的缺失导致花粉发育过程中的代谢紊乱，最终导致不育现象的产生.

3.2 四分体时期花蕾育性蛋白差异分析

从甜菜DY5-CMS及DY5-O的四分体时期花蕾蛋白中找到4个差异蛋白，分别为顺乌头酸酶、抗坏血酸过氧化物酶、延伸因子2及半胱氨酸合成酶.他们与甜菜的雄性不育有关.

顺乌头酸酶(aconitase，ACO)是三羧酸循环中能量转化的一个重要控制酶.在介导植物抗病、氧化胁迫和调控细胞死亡方面具有重要作用.张明珠等［16］发现顺乌头酸酶基因在杀雄剂SQ-1诱导小麦雄性不育花药中的表达，在生理型不育花药发育的单核早期cACO基因表达水平与同期可育花药相比显著升高，这与本实验的研究结果恰好吻合.

抗坏血酸过氧化物酶是叶绿体中清除H2O2的主要酶，在盐渍、热休克等逆境条件下均易导致转录水平和活性提高，但在本实验中其对育性生理生化的影响有待进一步研究.

延伸因子(elongation factor)是参与蛋白翻译延伸的重要蛋白质.研究发现，延伸因子在原核生物以及植物线粒体和质体等细胞的蛋白质合成延伸阶段发挥着重要的作用，在生长信号传导、抗旱、抗病等方面也有重要作用［17］.

3.3 单核期花蕾育性蛋白差异表达分析

在甜菜的3期花蕾中鉴定出的7个蛋白中，有5个是与植物光合作用有关的蛋白，分别是H型硫氧还蛋白 1、核酮糖 1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)大亚基、景天庚糖-1，7-二磷酸酶、氧增强蛋白1和光敏色素A，这些蛋白均在植物的光合作用中起着重要作用.另外2个分别是脂肪氧化酶(LOX)和RNA依赖的RNA聚合酶.

硫氧还蛋白可以通过还原靶蛋白中的二硫键参与细胞的一系列生化反应.在光合器官内，叶绿体铁氧还蛋白/硫氧还蛋白(Fd/Trx)参与叶绿体中还原磷酸戊糖途径酶的激活、氧化磷酸戊糖途径酶的暗激活等酶活性的调节［18］.本实验表明硫氧还蛋白在甜菜不育系3期花蕾中表达上调，说明在甜菜不育系的花药发育至此期该酶起到一定的作用.

核酮糖 1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)能催化光合作用的二氧化碳固定反应.该类蛋白的差异表达普遍存在于植物雄性不育系和保持系或不育系和转换系之间，在水稻、萝卜、小麦、甘蓝、番茄、烟草等植物雄性不育中均检测到Rubisco的功能缺陷或下调［19-20］.本实验在甜菜保持系的花蕾中也检测到这种蛋白，而在不育系中缺失.推测Rubisco在不育系中缺失影响发育过程中糖和蛋白质含量，而糖和蛋白质代谢的失调与不育系花药中小孢子的败育有关.花粉败育的同时营养代谢紊乱，合成受阻，分解加剧，影响雄性器官的发育，最终导致不育.

景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)在植物光合作用卡尔文循环过程中控制着碳的流入和再生，对核酮糖-1，5-二磷酸的再生也起着重要作用.SBPase活性的改变会影响植物的生殖生长，如表现出开花延迟，开花数减少的现象［21］.本实验发现在甜菜的保持系中SBPase的表达上调，推测不育系中SBPase缺失影响了核酮糖-1，5-二磷酸的再生，进而影响花粉的败育.

氧增强蛋白1(oxygen-evolving enhancer protein 1，OEE1)是由核基因锰簇稳定外周蛋白PsbO基因编码的定位于叶绿体上的蛋白.在甜菜不育系的单核时期花蕾中该蛋白表达下调，其作用机理尚不明确.

光敏色素是一种色素蛋白复合体，可以调节开花，还能控制性别表达和育性的转变.光敏核不育水稻在长日照下雄性不育，在短日照下可育.光敏色素通过调节光周期参与光敏水稻的雄性器官发育和育性转变，本实验在保持系中检测到的光敏色素A在不育系中表达下调或缺失，推测光敏色素A是与雄性不育有关的蛋白之一.

RNA依赖的RNA聚合酶(RDR)通过基因沉默途径参与植物的生长发育调节、逆境应答以及表观遗传修饰等生物学过程.本实验发现RDR在不育系甜菜的3期花蕾中表达下调或缺失，推测不育系中RDR的表达下调或缺失可能对甜菜不育系花粉败育后期有影响.

4 结 论

1)雄蕊原基分化期，找到6个与雄性不育有关的蛋白，其中5个蛋白还与能量和呼吸代谢有关，即NADH脱氢酶、二硫辛酰胺脱氢酶、可溶性无机焦磷酸酶、ATP合成酶的β亚基和ATP合成酶D链.这5个蛋白均在不育系中表达上调，只有一个在保持系中表达上调的蛋白是葡萄糖调节蛋白78.

2)四分体时期，分别是顺乌头酸酶、抗坏血酸过氧化物酶、延伸因子2及半胱氨酸合成酶可能与雄性不育有关.这些蛋白均在不育系中表达上调.

3)单核时期，筛选出6个可能与育性有关的蛋白.其中只有硫氧还蛋白在不育系中表达上调，其余5个蛋白均在保持系中表达上调.

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