转Bt基因抗虫棉的生物安全性研究进展

王立国　李菲　刘勤红等

摘要：作为一种生物技术产品，转Bt基因抗虫棉的生物安全性一直是人们关注和争论的焦点。世界上许多棉花主产国通过严格的试验从基因漂移、靶标害虫对Bt蛋白的抗性产生及治理对策、抗虫棉种植对非靶标昆虫及土壤生态系统的影响以及转Bt基因抗虫棉产品的食品安全性等方面进行了大量研究。迄今为止，尚未发现有关生物安全方面的问题。由于对棉铃虫等鳞翅目害虫的有效控制及其所产生的经济和生态效益，转Bt基因抗虫棉已经为越来越多的人们所接受，对维持世界棉花的可持续发展产生了不可替代的作用。

关键词：转Bt基因抗虫棉；生物安全；基因漂移；靶标昆虫；土壤生态系统

中图分类号：S562∶S336文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）07-0150-07

AbstractAs a biotech product， the biosafety of transgenic Bt cotton is always the focus of attention and controversy. The leading cotton producing countries in the world have conducted extensive researches from the aspects of gene flow， resistance of target insects to Bt protein and its countermeasures， the impacts of Bt cotton on non-target insects and soil ecosystem， as well as the food safety of Bt cotton products. So far， there was no potential hazard. As a result of its effective control of Lepidopteran insects and the economic and ecological benefits， the transgenic Bt cotton have been widely accepted，and it has been playing an irreplaceable role in maintaining the sustainable development of global cotton production.

Key wordsTransgenic Bt cotton； Biosafety； Gene flow； Target insects； Soil ecosystem

转Bt基因抗虫棉最早于1996年在美国获准进行商业化生产，随后澳大利亚、中国、墨西哥、南非、哥伦比亚、印度等国家开始引进和推广。截至2009年，美国的转基因棉花种植面积占总面积的88%，其中转Bt基因抗虫棉面积占65%以上。我国于1997年开始种植转基因抗虫棉，并迅速得到了大面积普及和推广，截至2012年，Bt基因抗虫棉在我国的栽培面积已达到棉花面积的75%以上。Bt基因抗虫棉的种植有效控制了棉铃虫等鳞翅目害虫的危害，大大降低了广谱性杀虫剂的应用，提高了棉花单位面积产量和效益，在棉花生产上发挥了重要作用。但是作为一种生物技术产品，Bt基因抗虫棉对人类健康和环境可能有潜在的负面影响，在试验研究的各个环节必须进行严格的审批和管理，并在释放前进行转基因生物安全性评价。近年来，国内外针对转Bt基因抗虫棉的安全性进行了大量研究，本文从Bt杀虫蛋白对人类及动物的食品安全性、基因漂移、Bt蛋白对土壤生态系统及棉田非靶标害虫的影响以及害虫抗性治理策略等方面就近年来国内外的相关研究进行了综述。

1Bt杀虫蛋白对人类及动物的食品安全性

1.1Bt杀虫蛋白对靶标害虫的作用机理

目前已经进行商业化应用的转Bt基因抗虫棉所含外源杀虫基因均来自苏云金杆菌（Bacillus thurigiensis， Bt），主要包括杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins， ICPs）基因cry1Ac、cry1Ab、cry2Ab2以及营养期杀虫蛋白（Vegetative Insecticidal Proteins， VIP）基因Vip3A等，其中Cry1蛋白对鳞翅目害虫有专一性；Cry2蛋白对鳞翅目和双翅目害虫有专一性；而VIP3A蛋白对棉铃虫、烟草夜蛾、红铃虫等某些鳞翅目害虫有专一性。Cry杀虫晶体蛋白在pH 9.5以上的昆虫碱性中肠液中溶解，在胰蛋白酶作用下，切除C-端，加工成有活性的毒蛋白，再与中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡（Brush Border Membrane Vesicles， BBMV）的受体结合，形成孔道，中肠细胞溶解破碎，导致死亡；而VIP3A毒蛋白在pH<7.5时即可溶解，直接与敏感昆虫中肠上皮受体结合，诱发细胞核溶解、细胞凋亡，从而导致害虫死亡[1]。由于两类杀虫蛋白的杀虫机理不同，与之结合的受体不同，不存在交互抗性，同时使用时具有协同增效作用，能显著提高杀虫效力。

1.2Bt杀虫蛋白对人类及动物的食品安全性

棉籽具有较高的赖氨酸含量，是一种重要的植物蛋白，常加工成食品或动物饲料。棉籽油是世界第六大植物油来源，通常作为烹调、煎炸用油或沙拉汁而广泛使用。因此转基因抗虫棉Bt杀虫蛋白对人类和动物的食品安全性备受关注。在转基因抗虫棉品种释放之前，通常对Bt杀虫蛋白进行氨基酸序列同源性比对、动物饲喂试验、体外消化分析及口服毒性测试等毒理检测来评价其安全性。

来自共同祖先的同源蛋白具有相似的氨基酸序列，通常具有结构和功能相似性。因此将杀虫蛋白与目前已知的人和动物的毒性蛋白质进行氨基酸序列相似性比较，可以发现杀虫蛋白对人类和动物的潜在毒性。通过将Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab2及Vip3A的氨基酸序列与PIR、EMBL、SwissProt及GenBank蛋白质数据库比对，均未发现其与已知毒蛋白具有序列相似性。另外将这些杀虫蛋白与过敏原蛋白氨基酸序列进行比对，也未发现序列相似性，因此认为Bt杀虫蛋白不具有已知过敏原的特性，即不存在潜在过敏性。

事实上早在转基因抗虫棉释放之前，在全球范围内Bt杀虫剂已在多种作物上得到了广泛应用，对控制鳞翅目害虫发挥了重要作用，没有对人类健康和环境产生不利影响[2]。人类或动物肠道为酸性环境，pH值约1.5，且缺乏可与Bt杀虫蛋白结合的受体[3～5]，因此Bt杀虫蛋白难以在人类及动物中发挥毒性效应。

Betz 等（2006）[6]以4 200 mg/kg体重的高剂量Cry1Ac蛋白饲喂小鼠，结果未显示出急性口服毒性效应；分别用Cry1Ac、Cry2Ab蛋白对蜜蜂、草蛉幼虫、寄生蜂、瓢虫、弹尾虫、蚯蚓、鹌鹑和小鼠等进行试验，在超过预期环境浓度10～100倍的剂量下，受试物种的生长发育均未发现明显不利效应。Castillo等（2001）[7]分别用含转基因和非转基因棉籽成分的饲料饲喂小鼠、河鲶、奶牛，在体重增长、生存能力、健康状况及产奶量等方面二者之间无显著差异。孟山都公司分别用含Cry1Ac蛋白500、1 000、4 300 mg/kg 体重的饲料饲喂大鼠、小鼠、家兔、羊等，均未发现明显的急性毒性效应，这些动物在体重、食物消耗及其它方面与对照无明显差异。先正达公司以1 450 mg/kg体重的Cry2Ab2蛋白饲喂小鼠，也未发现有毒性效应；用大剂量的Cry1Ab蛋白对地上节肢动物花蝽与瓢虫、地下节肢动物隐翅虫与弹尾虫、传粉动物蜜蜂、鸟类鹌鹑、哺乳动物老鼠、水生无脊椎动物水蚤、鱼类鲶鱼等进行试验，也均未发现对受试生物产生明显不利影响。

在印度，利用Bt棉籽饲料饲喂山羊、水牛、奶牛、家兔、鸟和鱼，结果均显示没有副作用，与对照试验动物无显著差异。陈松等用含抗虫棉棉籽的饲料饲喂小鼠、大鼠、鹌鹑和鲤鱼等，与对照相比均未发现明显差异，但长期饲养是否有慢毒性或对后代是否有影响还需进一步研究[8，9]。

由于棉花花粉粒大且有粘性，不会随风进行长距离扩散，接触到水生生物的可能性极小。种子和植物残渣也不易通过陆地径流或风扩散到水生群落。据此，美国国家环境保护署（EPA）认为：在遵循转基因生物标识制度的前提下，Cry蛋白对非靶标生物如鸟类、淡水鱼类、淡水无脊椎动物类、近海和深海动物、节肢动物捕食类/拟寄生类、蜜蜂、环节动物类以及野生哺乳动物等的毒性和传染性风险极小甚至是不存在的。

2基因漂移

2.1Bt基因向棉花近缘植物的转移

基因漂移是指一种生物的目标基因向附近野生近缘种的自发转移，使后者具有目标基因的一些优势特征，可导致整个生态环境发生结构性的变化。Bt基因自转基因植株向近缘植物和杂草的潜在转移问题是人们关注的焦点。

棉花的近缘杂草植物极少，主要有陆地棉野生种、夏威夷棉（Gossypium tomentosum）、瑟伯氏棉（Gossypium thurberi）和Gossypium comstocksii等。陆地棉起源于中美洲墨西哥一带，遍布于加勒比海、南美洲北部及一些太平洋群岛上。根据形态和地理分布，主要有7个陆地棉野生种系：尤卡坦棉（Yucatanense）、尖班棉（Punctatum）、阔叶棉（Latifolium）、马丽加朗特棉（Marie-Galante）、鲍莫尔氏棉（Paimeri）、莫利尔氏棉（Morrilli）和李奇蒙德氏棉（Richmondii）。陆地棉野生种属濒危物种，为了保护生物多样性，美国在陆地棉野生种存在区域如佛罗里达州中南部严禁种植转基因抗虫棉，以防止抗虫棉同野生陆地棉进行天然杂交。

夏威夷棉是一种稀有植物，仅存于美国夏威夷群岛，没有杂草化倾向或侵害特性。尽管在实验室和温室控制条件下，夏威夷棉可以同陆地棉杂交并产生可育后代，但通过分子标记分析未找到陆地棉基因在自然条件下向夏威夷棉转移的证据[10]。作为一种预防措施，美国环境保护署禁止Bt棉在夏威夷进行商业化利用。瑟伯氏棉不是濒危物种，存在于美国南亚利桑那山区，由于其仅含D染色体组，与陆地棉杂交不亲和，因此不可能发生天然异交。Gossypium comstocksii仅发现于印度古吉拉特邦北部非棉花种植区。另外，广泛分布于亚洲和非洲等地区的亚洲棉和草棉，均为二倍体A染色体组，也不能与陆地棉发生天然杂交。

因此，由于杂交不亲和性、花期不遇或地理隔离等原因，Bt基因自转基因抗虫棉向陆地棉野生种或近缘植物发生基因漂流或基因渐渗的可能性是基本上不存在的。

2.2Bt基因向土壤微生物的横向转移

横向基因转移（Horizontal gene transfer）是指DNA自一个物种向另一个物种的转移。在自然条件下苏云金芽孢杆菌的各亚种或菌系存在于土壤中，各种cry基因有可能通过转化、接合或转导等途径由苏云金芽孢杆菌向其它土壤微生物进行横向转移。然而没有证据显示从植物到微生物的横向基因转移或DNA表达[11]，即使有，也非常罕见[12]。与植物密切相关的细菌如农杆菌和根瘤菌基因组已被测序，其序列中不包含来自植物的基因。在基因构建过程中，启动子和编码序列已经被优化用于植物表达，而非细菌表达。

因此，在转Bt基因抗虫棉种植过程中，即使通过同源重组（Homologous Recombination）、异常重组（Illegitimate Recombination）、位点特异性重组（Site-specific Recombination）及质粒重建（Reconstitution of Plasmids）等途径发生由棉株向微生物的横向基因转移，在细菌中也不可能产生转基因相应的蛋白质，不会对原核生物的进化发生影响，也不会对人类或动物及环境产生不良影响[12]。事实上，对抗生素选择标记基因的研究表明，在实验室或大田条件下，均未发现标记基因由植物向细菌横向转移的证据，也未发现抗生素选择标记基因从植物向人类、反刍动物或其它动物的肠道菌群中横向转移的证据[13]。

2.3Bt基因向非转基因棉田的扩散

由于棉花为常异花授粉作物，天然杂交以昆虫传粉为主，异交率一般在3%～8%，高的可达15%以上。研究显示，在花粉源为1米的范围内，大部分棉田异交率低于10%。因此通过种植边行、设置隔离带或自然屏障等措施，可以有效防止Bt外源基因向非转基因棉田扩散。在隔离距离上，研究者的结论不尽一致，多数认为一般在30～100 m[14]。另外，世界各国在有机棉、优质专用棉和彩色棉的生产中，通常要求进行农场隔离、物理隔离或设置缓冲带；在种植、收获、运输、储存、清理及轧花等环节严防种子人为机械混杂。

3转基因抗虫棉对土壤生态系统的影响

3.1Bt杀虫蛋白在土壤中的活性

Bt杀虫蛋白在转基因抗虫棉根、茎、叶等主要器官中均存在，由抗虫棉的根系、残渣或花粉渗出的杀虫晶体蛋白，均可进入土壤中并在一定时间内保持活性[15，16]。然而，蛋白质的基本生物学特性决定了其一旦被分泌至土壤环境中，极易被微生物或非生物途径降解[17]。研究人员通过试验确定了土壤中杀虫蛋白的数量和持续性，认为Bt杀虫蛋白不可能在土壤中累积从而产生延迟效应，更不可能通过食物链进行累积。然而，分泌至土壤中的Bt毒素一旦与土壤粘粒结合则难以降解，其活性持续时间与粘粒含量呈正比，而与土壤pH值呈反比[18]。中性土壤中Bt毒蛋白的活性降低较快[19]。有研究认为与粘粒结合的杀虫蛋白自土壤中洗脱后将迅速被微生物降解[20]。一些研究在抗虫棉根际未能检出Bt毒蛋白[21，22]，也证实了Bt毒蛋白在土壤环境中的快速降解特性。

3.2Bt杀虫蛋白对土壤生态系统的影响

土壤微生物多样性对土壤生态系统的结构和功能有着重要作用。由于土壤微生物对环境变化极为敏感，很有可能会受到土壤中有活性的Bt毒蛋白的影响。孟山都公司研究了Bt棉株沥出液对土壤根际和非根际微生物菌群的影响，结果显示与对照无显著差异。一些研究也发现土壤微生物多样性及其活性在Bt玉米田和Bt棉田中与非转基因的对照大田没有显著差异[23，24]。但也有抗虫棉对土壤微生物数量或根际微生物环境产生显著影响的报道，认为造成土壤中微生物数量、组成与种类的差异不是Bt毒素本身引起的，而是由转基因植株的生理生化特性或表达产物的化学和生物学特性引起的[25]。

4抗虫棉种植对棉田非靶标生物的影响

4.1对非靶标害虫的影响

自从20世纪90年代中期，大量研究显示转Bt基因抗虫棉的种植对棉田非靶标害虫没有直接的影响[2，6，26～29]，对非靶标害虫的多样性也无显著不利影响[27～33]，反而由于减少了化学杀虫剂的应用，使棉田生态系统中的生物多样性有所增加[27，28，32]。然而一些研究认为转Bt基因抗虫棉可以通过对鳞翅目害虫的抑制对棉田生态系统中的非鳞翅目害虫产生间接影响。例如通过对鳞翅目害虫的影响而间接促进甘薯白粉虱的种群增长[34]，使棉蚜、棉叶螨、棉盲蝽、白粉虱和棉叶蝉等刺吸性害虫[36]以及斜纹夜蛾、甜菜夜蛾[37]的为害加重，加快了棉田红蜘蛛种群的发展速度等[37]。同常规棉田广谱性杀虫剂的使用相比较，转Bt基因抗虫棉的种植对非靶标生物的有害性大大降低[29，32，38]。

4.2对天敌的影响

国外大量的大田及实验室研究表明，表达Bt蛋白的转基因玉米、棉花对捕食性天敌无直接不利影响[29，33，39]。王武刚等[38]也调查发现转Bt基因棉对棉田自然天敌影响不显著。夏敬源等[41]在大田试验中发现转Bt基因抗虫棉田棉铃虫的捕食性天敌的数量减少不明显。Naranjo[33]在亚利桑那研究发现Bt棉对节肢动物天敌、蚁类和甲虫的数量和功能影响极小。吴孔明等[42]的调查结果则表明抗虫棉田瓢虫类、草蛉类和蜘蛛类捕食性天敌的数量与常规棉田相比大幅度增加。Jenkins[43]报道转Bt基因棉能间接提高天敌的捕食率[42]。由于棉铃虫等鳞翅目靶标害虫的减少，种植转Bt基因棉对寄生性天敌的间接影响相对较大，严重影响棉铃虫幼虫优势寄生性天敌的数量、寄生率、羽化率和捕食量[40，43]。

5害虫抗性治理策略

5.1害虫对Bt蛋白的抗性

连续种植Bt作物有可能导致害虫对杀虫蛋白产生抗性，从而使转基因作物丧失应用价值。目前，实验室和大田研究均已检测到害虫抗性的产生。梁革梅等[45]在实验室内对棉铃虫抗毒蛋白品系经过100多代筛选，抗性倍数达3 000多倍，研究发现棉铃虫对CrylAc蛋白的抗性是由单个不完全隐性基因控制的。Tabashnik等[46]的研究也表明棉铃虫对转Bt基因棉的抗性是常染色体控制的不完全隐性遗传。Meng等[47]用Bt棉叶连续对棉铃虫筛选50多代，对Cry1Ac蛋白的抗性达1 600倍以上， 也认为其抗性基因为单个主效基因的不完全隐性遗传。而且棉铃虫对Bt农药和转Bt棉品系间存在交互抗性[48]。在大田研究中发现在美国东南部Bt棉连续种植7～8年后，棉铃虫对Cry1Ac蛋白产生抗性，可能原因是Bt毒蛋白表达量没有达到高剂量水平[49]。刘凤沂等[50]用F1代法检测到田间棉铃虫对转Bt基因棉的高抗性等位基因频率。张洋等[51]研究表明，我国黄河流域棉区田间棉铃虫种群对Cry1Ac毒素尚未产生明显抗性，但对毒素的耐受性有升高趋势。

害虫对Bt杀虫蛋白的抗性机制目前还不十分清楚，有研究认为同杀虫蛋白与中肠细胞上受体蛋白结合能力的改变有关[51]；或者是由于昆虫中肠内pH值和酶的变化影响了杀虫蛋白晶体的溶解和活力[52，53]；也有人认为与抗性品系修复受损细胞的能力较强有关。

5.2害虫抗性治理策略

通过多基因策略或庇护所策略可以阻止或延缓害虫对毒蛋白产生抗性。多基因策略是指利用基因工程手段将几种Bt杀虫蛋白基因导入同一作物中。孟山都公司的BollgardⅡ棉花同时含有cry1Ac和cry2Ab2两种Bt基因，先正达公司的VipCotTM棉花则含有Vip3A和FLcry1Ab两种Bt基因。由于不同的毒蛋白具有不同的结合位点，不但提高了杀虫活性，扩大了杀虫谱，也使得害虫同时对两种蛋白产生抗性的几率大为降低。但只有害虫对两个基因无交互抗性，多基因策略才能发挥作用。

庇护所策略是指在Bt棉田周围种植20%的非Bt棉或其它寄主作物，并对其进行常规害虫防治，或者种植5%的非抗虫棉，不对其进行害虫防治。因为绝大部分在Bt作物中存活的抗性害虫将会与庇护所中产生的敏感害虫交配，若抗性为隐性遗传，则杂交后代在Bt作物中将会死亡，大大减慢了抗性的进化。尽管有室内研究发现由于发育时期的差异一些害虫的抗感种群的成虫不能随机交配，害虫抗性为不完全或非隐性遗传等[55，56]。Tabashnik等[49]通过对Bt玉米和棉田中6种主要鳞翅目害虫十余年抗性检测的数据分析表明，庇护所策略可以在大田中推广应用。目前庇护所策略作为一种害虫抗性管理措施已经在美国、印度、澳大利亚等国家推行。

假如Bt植株上害虫进食的毒蛋白剂量足够高，则几乎所有杂交后代将被杀死[57]，因此这种方法又称作“高剂量庇护所策略”。大量的研究认为在没有庇护所的情况下，害虫对毒蛋白的抗性进展很快，而庇护所可以延缓甚至阻止抗性的发生[58，59]。肖留斌等[60]在人工模拟“庇护所”和“非庇护所”条件下探讨了棉铃虫对Bt棉的抗性演变规律，发现与杂交棉铃虫品系相比，自交品系能更快地对Bt棉产生适应性，Bt棉对自交品系棉铃虫的抗性也易于下降，据此认为利用庇护所策略延缓棉铃虫对转Bt基因棉的抗性产生是可行的。由于我国抗虫棉种植区域主要集中在黄河、长江流域棉区，棉田面积小而分散，通常以棉铃虫的其它寄主作物如大豆、花生和玉米等作为天然庇护所。

6结语

转基因植物对生态环境、人类健康、非靶标生物的潜在影响，靶标生物的抗性进化，以及外源基因向野生种群及土壤微生物转移的可能性等是生物安全研究的重要内容，已经引起政府和社会各界的广泛关注。为此，世界各国制定了相应的政策、法规或条例来确保在转基因植物释放前对其安全性进行公正合理的评价，同时在实验室研究、中间试验、环境释放、生产性试验和越境转移等各个环节进行严格的审批和管理。

转Bt基因抗虫棉是全球范围内最早进行商业化种植的转基因作物之一，在世界主产棉国家中国、美国、印度等均得到了迅猛发展。近年来，国内外通过大量田间试验和实验室研究进行了各种风险的评估，基本上证实了其对环境、人类、动物及农业的安全性。迄今为止，尚未发现任何生物安全或害虫抗性等方面的事件。

然而，目前尚有一些问题存在争议，比如转Bt基因抗虫棉的种植可能导致棉田生物种群的变化等。多数研究的试验年限较短，不能评价外源转基因对生态环境或人类健康的长期潜在影响。因此，必须进一步规范安全评价的试验技术与方法，对转Bt基因抗虫棉的生态风险及食品安全性进行长期跟踪监测研究，建立与抗虫棉生产相配套的病虫害可持续治理策略，为转Bt基因抗虫棉的持续利用提供更加科学合理的依据。

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