液相色谱串联质谱负离子模式数据库的构建及对水产品中多种兽药的筛查检测

金 雁, 刘 瑜, 李晓东, 赵 颖, 蒋 施, 钟 钰, 郑 晨

(1. 沈阳出入境检验检疫局, 沈阳 110016;2. 上海爱博才思分析仪器贸易有限公司, 上海 200233)

金 雁1, 刘 瑜1, 李晓东1, 赵 颖1, 蒋 施1, 钟 钰1, 郑 晨2

(1. 沈阳出入境检验检疫局, 沈阳 110016;2. 上海爱博才思分析仪器贸易有限公司, 上海 200233)

建立水产品中兽药的液相色谱-串联质谱复合线性离子阱系统EPI扫描方式的数据库及筛查分析方法。7种兽药的最低检出限(LOD,S/N≥3)5 μg/kg,最低定量限(LOQ,S/N≥10)10 μg/kg。每种兽药添加10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 3个水平到空白基质中(n=6),回收率为83.2%～105.8%,相对标准偏差(RSD)为4.9%～10.2%。方法除两对离子对、保留时间外,利用子离子比对进行化合物的真伪鉴定,可以有效的排除假阳性。数据库建立过程简单快捷,借助离子阱的富集功能,实现对水产品样本中多种兽药残留的定性定量分析,且具有灵敏、准确的特点。

液相色谱-串联质谱复合线性离子阱; 数据库; 兽药筛查; 水产品

0 引 言

我国是水产品的养殖大国和出口大国,为了防治水生动物疾病、增加运输过程中的成活率、促进生长、提高经济效益,各类兽药被广泛应用于水产养殖中。但由于兽药在使用过程中存在滥用、误用及不遵守休药期等现象,其副作用体现的越来越明显,集中表现在以下几个方面:1)耐药菌株的产生;2)在水产品中产生药物残留;3)破坏微生态平衡;4)对免疫系统有抑制作用。其中因为在生物链顶端的人类长期食用药物残留的水产品将会产生耐药性甚至导致多种疾病,所以在水产品中产生的药物残留最为引起人们的关注。许多国家及国际组织对水产品中的兽药残留制定了最大允许残留限量( MRLs)[1-3],以保证水产品的安全卫生,进而维护水产品的食用安全。

目前,监控多种兽药的方法有很多种,如微生物检测法[4-5],液相色谱法[6],气相色谱法[7],分子印迹膜法[8],气相色谱质谱法[9],液相色谱质谱法[10-13],其中以液相色谱质谱法最为常见。氯霉素、氟苯尼考以及糖皮质激素类药物均有可供参考的国家标准[14-16],虽然有很多研究报告发表[17-18],但是由于水产品样本容易出现假阳性的特点,并且没有专门针对多种负离子化合物的实验方法。本研究应用液相色谱-三重四极杆/线性离子阱串联质谱法(QTrap LC-MS/MS)检测,具有从多级反应监测( MRM)→信息相关采集( IDA)→增强子离子扫描( EPI)→谱库检索的独有检测模式,开发针对负离子化合物数据库的构建方法。通过构建这些化合物的标准谱库,利用与标准谱库对比的方法鉴定阳性样品,提高方法的准确性。本研究针对水产品养殖中常用的抗生素及激素类药物,建立了氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、己烯雌酚、双烯雌酚、雌酮、地塞米松的LC-MS/MS谱库,并利用谱库检索建立水产品中7种药物的快速LC-MS/MS筛查方法。该方法对保障我国水产品的质量安全具有重要意义。

1 实验部分

1.1仪器与试剂

ACQUITYTM超高效液相色谱仪(美国Waters公司);AB Sciex Qtrap 5500三重四极杆-线性加速离子阱复合质谱仪(美国AB公司);Millipore-Elix-QE-QG超纯水机(美国Millipore公司);离心机(美国Thermo公司);MG-2200氮吹仪(美国EYELA公司);CPA 225D分析天平(德国Sartorius公司)等实验室常用设备。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、己烯雌酚、双烯雌酚、雌酮、地塞米松标准品,购于Dr.Ehrenstorfer 公司;乙腈、甲醇为色谱纯,水为超纯水;冰醋酸、无水硫酸钠、氯化钠均为分析纯;C18( 天津Bonna-Agela 公司) 。标准品用少量乙腈溶解,色谱纯乙腈定容配制1 mg/mL 标准储备液,再根据需要稀释成适当含量的标准工作液,4 ℃下保存,有效期为2 个月。

1.2色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100 mm,粒径1.7 μm),柱温40 ℃,进样量5 μL,流速0.3 mL/min。流动相A为超纯水,B相为乙腈。起始B相为5%乙腈,1 min～10 min B相梯度变化到40%,10 min～15 min B相梯度变化为95%,15 min～18 min B相维持95%,18 min～18.1 min B相梯度变化为5%,保持5 min。

1.3质谱条件

离子源:ESI-;喷雾电压(IS)-4 500 V,雾化气(GS1)50 mL/min,气帘气(CUR)30 mL/min,辅助加热气(GS2)60 L/min,离子源温度(TEM)600 ℃,碰撞气5 mL/min,4 种气体均为氮气;Q1和Q3均为单位分辨率;ESI模式、去簇电压(DP)和碰撞能量(CE)见表1。

表1 7种化合物的最佳质谱参数

1.4数据库构建

本实验中一共建立了2个数据库,一个是以化合物质谱图为检索信息的谱图数据库,一个是基于化合物保留时间的文本数据库。数据采集时,以氟苯尼考为例,浓度10 ng/mL,保留时间6.4 min,保留时间窗口60 s。其中谱图数据库的建立过程是分别设定20、35、50 eV的碰撞能量以及CE为35 eV,CES为15 eV的扩展能量,采集这4张质谱图用于化合物的匹配。对7种药物氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、己烯雌酚、双烯雌酚、雌酮、地塞米松进行EPI扫描,并编写7种药物的液相色谱串联质谱数据库,包括分子式、分子量、CAS编号、化学名、结构图等信息。另一个基于化合物保留时间的数据库,包括化合物的保留时间、准分子离子峰、特征碎片离子峰、碰撞能量等质谱参数。实验过程中,利用保留时间在文本数据库中的信息编写MRM采集方法,随后设定IDA条件,当色谱峰满足信号强度条件时将激发EPI扫描。

1.5样品处理

称取5.0 g水产品肉糜于100 mL离心管中,精确至0.01 g,加入20 mL 5% 醋酸乙腈提取液,同时加入2.0 g氯化钠和8.0 g无水硫酸钠均质提取1 min, 4 500 r/min 离心5 min,将上清液移入50 mL含750 mg C18分散剂的具塞离心管中,加入5 mL乙腈,水平振荡5 min,使吸附剂和提取液充分接触,以4 500 r/min离心5 min,静置10 min沉淀蛋白后,取5 mL上清液(相当于1.0 g样品)于10 mL试管中,40 ℃下氮吹浓缩至干。加入1 mL甲醇-水(1∶4)的定容液,经超声溶解和涡旋混匀后,过0.22 μm滤膜,供LC-MS/MS测定。

1.6检测模式

实验过程中,利用基于化合物保留时间的数据库找出所需监测化合物的MRM以及保留时间等数据信息,编辑MRM扫描方式,设定IDA→EPI实验条件,这里所有监测化合物均以CE为35 eV,CES为15 eV的扩展能量的碰撞能量记录MS/MS质谱数据,以便与数据库进行对比,实验中MRM→IDA→EPI的运行逻辑见图1。

步骤1 MRM探测扫描；步骤2 系统自动判断：探测扫描采集到的MRM信号强度超过预设值；步骤3 当步骤2的条件满足时，系统IDA自动切换(<1ms)为线性离子阱模式，进行增强子离子扫描(EPI)，获得探测扫描所得之母离子的高质量MS2谱图；否则返回步骤1，运行MRM扫描。

图1 MRM→IDA→EPI的运行逻辑图

2 结果与讨论

2.1质谱参数

通过优化离子源参数,得到7种化合物的最佳质谱参数见表1。

2.2实验结果

采用2.1中质谱参数,得到其中化合物标准溶液浓度为10 ng/mL的MRM总离子流图(见图2)。

图2 7种化合物的MRM总离子流图

2.3数据库的构建

以氟苯尼考为例,同时采集空白基质添加标准品浓度为10 ng/mL的MRM和EPI数据,分别得到MRM总离子流图和富集的二级子离子全扫描质谱图。记录氟苯尼考的MRM色谱峰保留时间,以及在软件上添加富集的二级子离子全扫描EPI质谱图,同时用于化合物的鉴定。图3中展示监控氟苯尼考得到的导航图。其中图3a为总离子流图,图3b为MRM的质谱图、图3c为MRM的色谱图,图3d为对应图3c中的全扫描质谱图。

选择图3d,点击鼠标右键,添加氟苯尼考的二级质谱图(Add a record,见图4),同时补充化合物名称、分子式、CAS号等相关信息,即可完成谱库的添加。按此方法得到氯霉素、甲砜霉素、己烯雌酚、双烯雌酚、雌酮、地塞米松6种药物的数据库信息。

图3 氟苯尼考导航图

图4 添加二级质谱图

2.4数据库的应用

实际扫描过程中,一旦某MRM通道采集的信号强度超过预设值后,即触发EPI增强子离子扫描模式,进而获得对应MRM通道的母离子的增强二级子离子全扫描质谱图,该EPI谱库可进行定性检索,得到相应的匹配度。匹配度的大小用以确证目标化合物的真伪,从而实现定性功能;与此同时,MRM通道采集的信号依然可以作为定量分析的数据,能够实现对目标化合物的同时定性定量分析,大大提高了工作效率。

2.5阳性样品鉴定

实验中,由于色谱分离的局限性,不能确定在保留时间误差范围内出现的色谱峰为氟苯尼考,此时需要借助EPI数据库分析色谱峰。将未知样品采集进行EPI数据谱库检索,软件自动给出匹配值(正匹配值/反匹配值)用于色谱峰鉴定见图5。

将样品的EPI谱图与空白基质标准品加标建立的EPI谱库中谱图进行比较,通过比较二级质谱图,未知样品EPI质谱图(图5a)与氟苯尼考标准溶液EPI质谱图(图5b)极为相似,与苄哌丁苯(图5c)相差甚远。并且得到它们的匹配结果(图5d),其中Fit值( 匹配值)是用标准物质谱图与可疑样品谱图进行对比后获得的相似度值,满分为100,Fit值越大可信度越高说明该化合物的可能性越大;Revfit值(反相匹配值)是用可疑样品谱图与标准物质谱图进行对比后获得的相似度值;Purity 值(纯度值)是综合前两种结果得出的数值。检索结果按Purity值从大到小排序,从表中可明显得出可疑阳性样品中氟苯尼考阳性的结论。

图5 氟苯尼考阳性样品确证

2.6精密度与检测限

取处理好的水产品提取液注入QTrap系统中,采集5 ng/mL基质加标时得出信噪比分别为:氯霉素≥36、甲砜霉素≥23、氟苯尼考≥30、己烯雌酚≥23、双烯雌酚≥4、雌酮≥12、地塞米松≥221。按照S/N≥3为方法的检测限,出于简便和实际意义角度考虑,将7种负离子的检出限统一定为5 μg/kg。按照同样方法,S/N≥10为方法的定量限为10 μg/kg。

配制10～5 000 ng/mL的系列混合标准溶液,采集数据并绘制标准曲线,得到7种化合物的线性相关系数R为0.993 6～0.999 9,线性良好。每种兽药添加10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 3个水平到空白基质中,每个水平重复6次,得到回收率为83.2%～105.8%,相对标准偏差(RSD)为4.9%～10.2%,完全满足日常实验室检测的重现性要求。

2.7实际样品测试

购市售水产品按照1.5步骤处理,经液相色谱质谱测试,通过空白基质添加的方式验证方法的准确性。检验15种水产品中均未检出阳性样品。

3 结论

日常工作中,由于检测样品基质比较复杂,检验过程中常出现大量假阳性的情况。针对该状况采用QTrap质谱特有的MRM→IDA→EPI扫描,实现一次进样定性定量,大大简化检验流程,增强检测结果信心,有效确认化合物真伪。数据库建立过程,简单快捷,可实现一次进样得到样本的定量和定性数据,极大地提高工作效率。此外,实验证明由于QTrap系统的富集功能,能够实现即使在低浓度条件下,依然可以得到化合物高质量的二级质谱图,对于限量较低的药物的筛查确证非常实用。

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Developmentofveterinarydrugsdatalibraryandscreeningmethodofnegativemodebyliquidchromatography-tandemmassspectrometryinaquaticproducts

JINYan1,LIUYu1,LIXiaodong1,ZHAOYing1,JIANGShi1,ZHONGYu1,ZHENGChen2

(1. Shenyang Enter-exit Inspection and Quarantine Bureau of the P.R.China, Shenyang 110016, China; 2. AB SCIEX Asia Pacific Application Support Center, Shanghai 200233, China)

A liquid chromatography tandem triple-quadrupole linear ion trap mass spectrometric (QTrap LC-MS/MS) EPI mode was developed for the data library and simultaneous screening of veterinary drugs residual in aquatic products. The results showed that the limits of detection (LOD, S/N≥3) were 5 μg/kg and the limits of quantity(LOQ, S/N≥10) was 10 μg/kg for the veterinary drugs. The average recoveries (n=6) of the veterinary drugs in aquatic product samples at three levels 10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg were from 83.2% to 105.8% with the relative standard deviations (RSD) between 4.9% and 10.2%. Besides using two transitions and retention time, product ions were matched with the data libraries to identification the compounds. This process is proved to exclude the false positive samples effectively. The setting of the data library is quick and easy, and the ion-trap will help to apply the qualitative and quantitative determination of veterinary drugs in aquatic products with sensitive and accurate characteristics.

QTrap LC-MS/MS; data Library; veterinary drug screening; aquatic products

2014-04-26。

国家质检总局科技计划项目(2011IK215,2014IK129); “十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAK10B04-9); 辽宁出入境检验检疫局科技计划项目(LK33-2007)。

金 雁(1974-),女,辽宁沈阳人,沈阳出入境检验检疫局高级工程师,硕士。

1673-5862(2014)04-0496-06

O661.1

: A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2014.04.009