循环肿瘤细胞与肺癌临床病理特征的关系＊

刘春花，杨 政，李 娜，巩 平△

（1.石河子大学医学院，新疆石河子832000；2.石河子大学第一附属医院肿瘤内科，新疆石河子832000）

肺癌是严重威胁人类健康的疾病之一，发病率呈逐年上升趋势，病死率居所有恶性肿瘤之首。其远处转移是导致患者死亡的主要原因。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）的出现是发生远处转移的前提，是形成转移灶的关键环节［1－2］。有研究显示，CTC不仅可有效判断肺癌患者预后，还能预测和监测辅助治疗效果［1，3］。本研究旨在应用免疫磁珠阴性富集联合免疫荧光细胞化学法检测肺癌患者的CTC，分析其与患者临床病理因素的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集石河子大学医学院第一附属医院2012年9月至2013年6月肺癌患者65例（肺癌组），男49例，女16例，年龄40～76岁，平均60.8岁；鳞癌24例，腺癌19例，小细胞肺癌13例，其他（腺鳞癌、大细胞癌、肺泡细胞癌、癌肉瘤）9例。肺良性疾病患者10例（肺良性疾病组），男7例，女3例，年龄38～73岁，平均58.3岁；肺炎4例，支气管哮喘急性发作3例，慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性发作2例，慢性支气管炎急性发作1例。健康志愿者10例（健康组），男6人，女4人，年龄35～70岁，平均56.1岁。纳入研究对象按各自设定标准。肺癌组纳入标准：（1）年龄18～80岁；（2）经组织病理学检查确诊为肺癌；（3）入组前未接受任何抗肿瘤治疗。排除标准：（1）缺乏肺癌病理学诊断；（2）已接受手术化疗及放疗；（3）有其他恶性肿瘤病史；（4）依从性差。肺良性疾病组纳入标准：（1）符合非肿瘤相关疾病临床诊断标准；（2）有微生物学或组织学证据；（3）病理学检查除外肺恶性肿瘤。健康组纳入标准：（1）年龄18～80岁；（2）无肺癌相关高危因素；（3）常规体检及肝肾功能无异。肺良性疾病组及健康组统称对照组，所有研究对象均签署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 抗CD45磁珠抗体购自德国Miltenyi Biotec公司；鼠抗Pan－CK购自美国Cell Signaling公司；Envision试剂盒购自中杉金桥公司（批号：Cat NO.D11－110）。

1.2.2 样本采集 严格消毒后，应用真空采血针采集肘正中静脉血，弃去穿刺后的前2mL，采集此后的7.5mL静脉血加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，并在采集后的24h内富集肿瘤细胞。

1.2.3 免疫磁珠富集 将血液和淋巴细胞分离液复温至18～25℃，取7.5mL抗凝血与等量PBS液充分混匀后，缓慢贴壁加入淋巴细胞分离液层面上（2∶1）；室温下2 000r／min（离心半径16cm）离心20min；吸取环状乳白色单核细胞层，加入5 mL PBS液重复洗2次，室温下2 000r／min（离心半径16cm）离心15min。将细胞沉淀重悬于80μL磁珠缓冲液中，加入20μL抗CD45抗体，用手轻轻敲打混匀后置于4℃冰箱孵育15min；再加入2mL磁珠缓冲液，室温下2 000r／min（离心半径16cm）离心10min；弃上清液（用枪尖吸取上清液，留1mm水膜），加入500μL缓冲液重悬细胞。将细胞重悬液过磁珠MS分流柱，加入500μL磁珠缓冲液洗涤MS分流柱2次，收集从分流柱下流出的液体，室温下2 000r／min（离心半径16 cm）离心10min；弃上清液，沉淀均匀涂于防脱载玻片上，室温风干后4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，每次5min，室温风干。如不立即进行免疫细胞化学染色，待玻片干燥后置于－80℃冰箱备测。

｀1.2.4 免疫细胞化学染色（Envision法） 取出切片，PBS洗3次，每次5min，加入细胞角蛋白（Pan－CK）抗体，4℃冰箱过夜。PBS洗3次，每次5min，加二抗（Envision工作液），37℃温箱孵育20min。PBS浸洗3次，每次5min，DAB溶液显色。苏木素复染3～5min，酸酒精分化、脱水、透明、中性树胶封片。

1.2.5 CTC的判定标准及阳性定义 形态学标准：（1）细胞呈圆形、椭圆形或长形，长径大于10μm；（2）光镜下可见完整细胞形态及细胞核。光镜阳性标准：（1）有完整细胞膜，Pan－CK染色阳性，细胞质呈蓝黑色或褐色；（2）细胞长径大于10 μm；（3）核浆比失常。结果判定：由两位经培训实验员在光镜下分别观察细胞显色情况，有分歧时由第3人协助判定。阳性界定值：目前尚无国际标准化CTC的阳性判定标准，本文以见到CTC即为阳性结果。

1.3 统计学处理 实验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，计数资料采用列联表分析，确切概率法检验，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CTC检测结果 对照组（20例）中均未检出CTC，肺癌组中45例检出CTC，阳性率为69.23%（45／65），CTC数值为1～58个，中位数4个。两组比较差异有统计学意义（χ2＝8.047，P＝0.018），见图1。

图1 免疫细胞化学染色结果（Envision×400）

2.2 CTC与肺癌患者临床病理特征的关系 对65例肺癌患者CTC与临床特征间的关系进行统计分析，结果表明，TNM分期Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者CTC阳性率分别为23.08%（3／13）、50.00%（6／12）、90.00%（36／40），各亚组 CTC阳性率差异有统计学意义（P＝0.000）；转移性（M1期）肺癌患者CTC阳性率为83.33%（35／42），较非转移性（M0期）肺癌患者CTC阳性率43.48%（10／23）显著升高（P＝0.002）；随着转移部位个数（0、1、2、3）的增多，CTC阳性率呈升高趋势（43.48%、83.33%、87.50%、75.00%），各亚组CTC阳性率差异有统计学意义（P＝0.024）；CTC阳性率在Pan－CK19片段（Cyfra21－1）＜5.6μmol／L组（53.33%，16／30）与Cyfra21－1≥5.6μmol／L组（82.86%，29／35）间差异有统计学意义（P＝0.021）；在乳酸脱氢酶（LDH）＜270U／L组（55.0%，22／40）与LDH≥270 U／L组（92.0%，23／25）间差异也有统计学意义（P＝0.004）。而CTC阳性率与肺癌患者病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移的部位及癌胚抗原（CEA）值均无关（P＞0.05），见表1。

表1 65例肺癌患者CTC与临床病理特征的关系

续表1 65例肺癌患者CTC与临床病理特征的关系

3 讨 论

远处转移是肺癌的恶性标志和重要特征，也是导致肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。而研究显示，CTC与肺癌患者的隐性微转移密切相关，是发生远处转移的前提，形成转移灶的关键环节［1－2］。本研究发现，在13例早期肺癌患者中有3例（23.08%，3／13）检出CTC，同样证明CTC的全身扩散是肺癌发生、发展的早期事件，虽然血液中检测到CTC并不意味着必定形成转移灶，但有助于及早确定转移复发高危人群，加强这部分患者的随访并采取相应的治疗措施，对减少肿瘤的转移复发、提高生存率具有重要意义。

随着现代生物学技术的飞速发展，在CTC检测中，细胞富集技术、免疫学技术得到了广泛应用，使得检测的敏感性和特异性亦大大提高［4］。目前，免疫细胞化学染色仍是评价CTC检测方法的金标准［5］。由于该技术检测的细胞数量少，检出率低，本研究加用了免疫磁珠阴性富集法富集CTC，以更好地获取肿瘤靶细胞。免疫磁珠系统对外周血CTC具有高效的回收率（＞85%）［6］。本实验中，采用免疫磁珠阴性富集联合免疫细胞化学染色分离鉴定CTC，65例肺癌患者中45例检出CTC，总阳性率为69.23%，与周小昀等［7］报道基本一致；10例肺良性疾病患者及10例健康志愿者中均未检出CTC，证实检测具有极高的特异性（100%）。

近几年，大量的研究证明CTC在肺癌复发转移中起重要作用，是可能更有效评估患者预后，及时监测病情进展的指标。De Giorgi等［8］研究发现，CTC对肿瘤患者的预后预测较其他的方法更准确，比PET－CT的方法更加敏感和经济。Hou等［9］检测了97例小细胞肺癌患者的CTC，发现CTC计数与无进展生存期（PFS）、总生存期（OS）均呈负相关，多因素分析显示，CTC可作为患者PFS和OS的独立预测指标。Krebs等［10］检测了101例晚期非小细胞肺癌患者CTC，亦得出CTC计数是预测患者OS的最有价值的独立指标。因此，检测肺癌CTC状态对准确判断患者预后，及早发现疾病进展及制订个体化治疗方案具有重要意义。本研究分析65例肺癌患者CTC与临床特征的关系，结果显示CTC阳性率与患者病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移的部位（肝、脑、骨、肾上腺、胸膜）无关，与肺癌患者的临床分期、M分期、发生远处转移部位的个数密切相关，与国外研究结果相一致［11］。临床分期越晚，CTC检出率更高，且M1期患者CTC阳性率较M0期患者明显升高（83.33%vs.43.48%），提示CTC阳性与远处转移密切相关，进一步证实了CTC在远处转移病灶形成中的重要作用；而在M0期即影像学未发现远处转移的患者中仍有如此高的CTC检出率，提示在监测肺癌远端转移方面，CTC较传统的影像学等检查更加及时、敏感，有利于肺癌患者的个体化治疗。

肿瘤标志物反应肿瘤的发生、存在与生长。国外有研究报道［12］：肿瘤标志物升高程度与癌细胞数量及转移有关。血清中Cyfra21－1的水平可作为肺癌手术和放化疗后追踪早期复发或转移的有效指标，其高值提示疾病处于进展期且预后不佳［13－14］。LDH是一种糖酵解酶，在恶性肿瘤患者中LDH 明显增高［15］，且有报道血清LDH随着肺癌患者病情的进展呈逐渐升高的趋势［16］。本文观察了Cyfra21－1及LDH与CTC的关系：Cyfra21－1、LDH二者高值组CTC阳性率较低值组明显升高 （Cyfra21－1：53.33%vs.82.86%；LDH：55.00%vs.92.00%），初步研究表明CTC与Cyfra21－1及LDH具有一定相关性，下一步应扩大样本量，并对患者进行随访跟踪，动态监测患者CTC、Cyfra21－1及LDH，观察其治疗后是否仍具有相关性，进一步研究CTC在判断肺癌患者预后的临床价值。

CTC是形成远处转移灶的重要前提和基础，及早检测CTC对临床医师准确判断预后和病情具有重要指导作用；动态监测患者CTC变化，有利于及时了解患者病情，为制订个体化的治疗方案提供依据。本研究仅初步探讨了肺癌患者CTC与临床病理特征之间的关系，未来的研究应通过随访观察，进一步阐述CTC与肺癌患者预后的关系，并对CTC在肺癌综合治疗中的应用价值进行深入探讨。

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