单增李斯特菌非可培养状态的诱导与PMA-qPCR检测

,,秀丽，,，*,

(1.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640； 2.广东省惠州市质量计算监督检测所，广东惠州 516000))

单增李斯特菌非可培养状态的诱导与PMA-qPCR检测

黄韵1,余以刚1,黄秀丽2，李晓凤1,肖性龙1，*,吴晖1

(1.华南理工大学轻工与食品学院,广东广州 510640； 2.广东省惠州市质量计算监督检测所，广东惠州 516000))

在9%(w/v)NaCl条件下,通过温度、pH两种因素诱导一株单增李斯特菌进入“活的非可培养”(viable but non-cuturable,VBNC)状态。通过LIVE/DEAD Baclight活菌检测试剂盒检测细菌总数与活菌数,比较单增李斯特菌状态及数量的差异与变化。结果显示,在2℃、pH6.0条件下单增李斯特菌活菌全部进入VBNC状态。用PMA-qPCR对经诱导的四份菌液进行检测,结果表明该方法能快速、准确地测出死菌背景下的活的单增李斯特菌。

VBNC,PMA,单增李斯特菌,活菌,检测

单增李斯特菌是一种食源性致病菌,常见于海鲜、生肉、鲜奶等食物中,食用被该菌污染的食物后能引起食物中毒,引发李斯特菌病。单增李斯特菌能在0.5～45℃的温度范围内生长,在pH4.7～9.2、高渗透压条件下仍能繁殖[1]。Bajard等[2]验证单增李斯特菌在-2℃仍能在肉汤培养基中生长。因此,在低温条件下仍能保持繁殖的单增李斯特菌对冷鲜、冷藏食品等构成重大威胁。至今已有60多种细菌被证实可进入VBNC状态[3]。VBNC状态的细菌具有代谢活性,但无法在常规培养基上生长。这是细菌面临生存威胁时的一种生存策略[4],而在特定条件下,VBNC菌能恢复繁殖能力及毒性[5]。因此,虽然VBNC状态的致病菌不具有繁殖能力,但仍对人类健康具有潜在危害。已知能诱导细菌进入VBNC状态的因素很多[6-10],Besnard等[11]利用自然环境的水,通过调节菌种量、温度、pH、盐度、光照等因素,诱导出VBNC状态的单增李斯特菌,并用CTC-DAPI法、DVC法验证。Dreux等[12]利用低相对湿度在香菜叶上诱导出VBNC状态的单增李斯特菌,Cunningham等[13]利用食品防腐剂诱导单增李斯特菌进入VBNC状态。随着细菌VBNC状态概念的提出与证实,传统方法已不能满足人们对细菌(尤其是致病菌)的检测需求。PMA-qPCR技术是近年新兴的活菌检测技术,由Nogva等[14]最先提出。其原理是利用PMA渗入受损细胞膜与DNA结合,通过抑制DNA在PCR反应中扩增达到区分死、活菌检测的目的。本研究主要通过利用NaCl浓度、pH、温度几个因素诱导单增李斯特菌进入VBNC状态,并尝试运用PMA-qPCR技术对诱导后的菌液进行检测,验证该方法对单增李斯特菌活菌定量检测的适用性。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

本实验所用菌株为单增李斯特菌(CMCC34761),为实验室保存菌种。细菌培养采用脑心浸液肉汤(BHI)培养基(蛋白胨10g/L,脱水小牛脑浸粉12.5g/L,脱水牛心浸粉5g/L,氯化钠5g/L,葡萄糖2g/L,磷酸氢二钠2.5g/L),pH7.4±0.2。培养基经过121℃,20min灭菌后使用。将细菌分别接种到30mL BHI液体培养基中于37℃下180r/min摇床中过夜培养20h(OD600≈1)。采用含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)培养基(胰胨17g/L,多价胨3g/L,酵母膏6g/L,氯化钠5g/L,磷酸氢二钾2.5g/L,葡萄糖2.5g/L,琼脂15g/L,pH 7.2～7.4)作为固体培养基,121℃,20min灭菌后使用,用于平板法测可培养菌数。

所用试剂均为化学纯或分析纯；LIVE/DEAD® BacLightTMBacterial Viability Kit购自 Life Technologies公司(美国)；细菌基因组DNA快速提取试剂盒 购自北京艾德莱生物科技有限公司；PCR Amplification Kit 购自TaKaRa公司。

SPX-250B生化培养箱,高压蒸汽灭菌锅 购自上海博讯实业有限公司；水浴锅 购自雷蒙特实验设备公司；ESCO生物安全柜 购自浩瀚有限公司；ABI7500荧光定量PCR仪器 购自应用生物系统公司(美国)；卤钨灯(650W) 购自 Osram公司(德国)；台式高速冷冻离心机 购自Eppendorf公司(德国)；多微孔板检测器Victor3 V 1420 multilabel counter 购自Perkin Elmer公司(美国)。

1.2实验方法

1.2.1 VBNC状态的单增李斯特菌的诱导 取生长至对数平台期的单增李斯特菌菌液30mL于50mL无菌离心管中,9000r/min离心5min,弃上清。用20mL无菌去离子水重悬洗涤菌体三次后,以9% NaCl(w/v)溶液(无菌)重悬于1L锥形瓶。调整细菌浓度为1.8×107CFU/mL,最终菌液体积为500mL。分别调节pH为6.0或7.0(0.1mol/L HCl),分别在2、25℃温度下进行诱导。诱导过程中利用平板计数法观察细菌可培养数的变化。由于低氯化钠浓度对诱导单增李斯特菌进入VBNC状态具有积极作用,能缩短细菌失去可培养性所需的时间[11],因此实验中四个诱导液均使用含有9% NaCl(w/v)的无菌水。

为测定细菌可培养数,每次取1mL诱导菌液进行梯度稀释,吸取100μL稀释液涂布于TSA-YE固体培养基上,每个浓度设置三次平行实验,37℃下培养48h后进行计数。在诱导期,当上述方法无菌落检出时,为确认菌液中是否仍存在可培养细菌,取10mL菌液于无菌离心管中,9000r/min离心5min后用1mL无菌去离子水重悬,并取100μL涂布于TSA-YE固体培养基上培养后观察。当连续三天平板上无菌落长出时,确认细菌失去可培养性。

1.2.2 细菌总数与活菌数量的测定 细菌总数及活菌数使用LIVE/DEAD® BacLight Bacterial Viability Kit按操作说明书进行定量测定,通过多微孔板检测器收集荧光强度。死菌数、VBNC菌数计算公式如下,数值均采用三次平行实验所得的平均数(单位以CFU/mL记,细菌可培养数通过平板计算法测定)：

死菌数=细菌总数-活菌数

不可培养活菌数=活菌数-可培养菌数

1.2.3 PMA-qPCR检测 诱导期结束后,利用荧光定量PCR检测热灭活的死菌以及新鲜培养的单增李斯特菌的细菌总数。通过使用PMA-qPCR技术检测以上各种菌液中的活菌数。死菌采用热灭活方法制备,取1mL新鲜的单增李斯特菌菌液,用无菌水洗涤两次后重悬,调整菌浓度为1.8×107CFU/mL(与诱导液起始浓度一致),于沸水浴中处理2min后取出,并以平板计数法确认无菌落产生。另取1mL新鲜菌液,经两次无菌水洗涤后重悬,同样调整细菌浓度为1.8×107CFU/mL,即为活菌样本。

1.2.3.1 PMA处理 分别取500μL四种诱导的单增李斯特菌、热灭活的死菌及活菌的菌液于1.5mL离心管中,9000r/min离心3min,等体积无菌水重悬。菌液中加入5mg/mL的PMA储备液1μL使菌液中PMA终浓度为10μg/mL,充分混匀后,于室温下暗处孵育10min。将离心管水平放置于冰上,于卤钨灯下方20cm处进行5min光照,期间轻轻摇晃冰盒保证溶液得到充分照射。

1.2.3.2 DNA提取以及荧光定量PCR检测 取500μL经过PMA处理和未经过PMA处理的各诱导菌液于1.5mL无菌离心管中,9000r/min离心5min,按照细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明操作提取基因组DNA,作为定量PCR反应模板。用DNAStar Seqman模块(DNASTAR,Inc)对单增李斯特菌进行基因序列比对、用Primer Express 2.0(Applied Biosystems)设计引物和探针。

上游引物5′-TTC ATC CAT GGC ACC ACC A-3′,

下游引物5′-TAT ACT TAT CGA TTT CAT CCG CGT GT-3′,

探针FAM-5′-CCG CCT GCA AGT CCT AAG ACG CCA-3′-BHQ1。

荧光定量PCR反应体系为25μL,其中含10×(NH4)2SO4缓冲液2.5μL,25mmol/L Mg2+溶液3.5μL,25mmol/L,dNTPs 1μL,15μmol/L前后引物各1μL,10μmol/L探针1μL,模板溶液2μL,Taq DNA聚合酶2.5U,DEPC水12.5μL。反应条件：95℃预变性2min；95℃变性5s,60℃、40s(收集荧光信号),共40个循环。反应结束后40℃保温2min。每个荧光定量PCR反应各三次平行实验,计算平均Ct值和样本标准差SD值。

2 结果与讨论

2.1诱导条件的影响

图1a～图1d分别给出了在2℃、pH6.0,2℃、pH7.0,25℃、pH6.0及25℃、pH7.0四种不同诱导条件下,诱导期细菌总数、活菌数、细菌可培养数、不可培养活菌数及死菌含量的变化。如图所示,在诱导过程中,通过平板计数法计算细菌可培养数,除图1b(2℃,pH6.0条件)的样本的可培养菌数降为0(90d后)外,图1a、图1c、图1d的可培养菌数在100d诱导期结束后分别为4.3×106、3.3×106、9.3×105CFU/mL左右。

2.2诱导过程中细菌状态与数量的变化

LIVE/DEAD活菌检测试剂盒曾被Boulos等[15]用于检测饮用水中的活菌数与细菌总数。LIVE/DEAD® BacLight活菌检测试剂盒中含有两种核酸染料：SYTO9及PPI(碘化丙啶)。SYTO9染料能穿透细胞膜进入细胞,与DNA结合后发出绿色荧光。PPI不具有细胞膜穿透性,通过渗入膜损伤细胞与DNA结合,发出红色荧光,而在PPI与SYTO9同时结合细胞DNA的情况下,细胞发出红色荧光[16]。因此,经试剂盒染料处理后的菌液,其总菌数为红色荧光细胞与绿色荧光细胞之和,活菌数为发出绿色荧光的细胞总数。

如图1所示,诱导期结束后,图1b 2℃,pH6.0的诱导液中,其细菌可培养菌数降为0,而活菌数为1.4×107CFU/mL,说明诱导液中所有的单增李斯特菌进入VBNC状态。其他三种诱导液中,活菌检出量分别为1.6×107、7.2×106、5.2×106CFU/mL(依次为图1a、图1c、图1d),而可培养数为4.3×106、3.3×106、9.3×105CFU/mL(依次为图1a、图1c、图1d),活菌检出量远大于检出的可培养菌数,说明三种含有可培养细菌的菌液中,除了可培养出的细菌外,还含有另一部分无法通过培养法检出的活菌,即VBNC菌。由于四种诱导液中的VBNC菌数量分别为1.2×107、1.4×107、3.9×106、4.3×106CFU/mL(依次为图1a、图1b、图1c和图1d)。与25℃相比,2℃下有更多的细菌进入VBNC状态。这可能是相对于常温来说,2℃低温使细菌面临更大的生存压力,因为进入VBNC状态是细菌应对外部不利条件时的一种生存策略[4]。然而,在诱导过程中,在控制温度和pH两个单一变量的四种情况下,只有在2℃、pH6.0的条件下单增李斯特菌大量、全部进入VBNC状态,说明单一因素的刺激不足以对细菌进入VBNC状态有决定性的影响,VBNC菌的形成可能更多的取决于温度、pH、低浓度氯化钠以及营养缺乏等各种因素的共同作用。此外,细菌的菌株不同对诱导条件的响应也不尽相同,如Vattakaven等[17]对溶珊瑚弧菌进行VBNC诱导后发现,不同来源的同种细菌,进入VBNC状态的诱导条件及VBNC状态的菌数会有差异,而同种细菌不同菌株间对诱导条件的响应也不尽相同甚至相反[11]。因此细菌进入VBNC状态的成因复杂,至今未有明确的定论。

此外,相对于25℃诱导的菌液,2℃下诱导的菌液中活菌含量更高,说明低温对提高细菌的存活率有较大影响,可能是因为溶液中含有9% NaCl(w/v),而低温降低了细胞内部新陈代谢和能量转换的速度,从而延迟了细胞的损伤。但温度相同的条件下,pH对活菌水平仅有轻微影响。

2.3单增李斯特菌的PMA-qPCR检测

利用LIVE/DEAD® BacLight活菌检测试剂盒可快速检测样本的总菌数和活菌数,然而对于未知样本,LIVE/DEAD® BacLight活菌检测试剂盒无法对其中含有的细菌种类进行鉴别。而荧光定量PCR技术可检测出样本中的总菌数,但不能对死菌与活菌含量进行区别检测。PMA-qPCR联用技术是近年来快速发展的新型活菌检测技术,它克服了定量PCR技术的不足,利用PMA渗入膜损伤细胞,与DNA共价结合,从而抑制膜损伤细胞DNA在PCR反应中的扩增,从而实现对样本中的活菌进行快速的定性与定量检测[18]。

2.3.1 标准曲线的制定 取新鲜培养、菌浓度为2.3×109CFU/mL(平板计数法检测)的单增李斯特菌活菌液,使用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA后,对DNA进行0、10、100、1000、10000倍的梯度浓度稀释。稀释后的DNA作为荧光定量PCR反应模板制定标准曲线(见图2)。

图2 荧光定量PCR标准曲线

2.3.2 PMA-qPCR检测 对经过PMA处理以及未经过PMA处理的四种诱导的单增李斯特菌、活的单增李斯特菌及死菌经进行DNA提取,得到的DNA作为荧光定量PCR反应模板。各样本中的细菌总数及活菌数如图3所示。

图3 qPCR和PMA-qPCR检测 不同条件下的单增李斯特菌

从图3可知,经过PMA处理和未经PMA处理的单增李斯特菌活菌的qPCR反应结果得出的细菌总数、活菌数都与实际值很接近(1.8×107CFU/mL,log(CFU/mL)约为7.26)。而未经PMA处理的死菌,检出的总菌数与活菌样本一致,但其活菌数无法检出,说明PMA可以有效抑制死菌DNA扩增,将PMA与qPCR结合起来的检测方法可以准确地对样本总菌数和活菌数进行区别检测。从图3可见,四个诱导液样本中的细菌总数与活菌、死菌中的细菌总数接近,说明单增李斯特菌在经历诱导后,菌液浓度并未发生较大变化,这与LIVE/DEAD® BacLight活菌检测试剂盒的结果是一致的。除此以外,通过PMA-qPCR方法检出的四种诱导液中的活菌含量与LIVE/DEAD® BacLight活菌检测试剂盒检测的活菌含量也接近,说明PMA-qPCR法能在混合样本中对活菌进行有效、准确的定量。

3 结论

通过比较与考察两种温度、pH对诱导一株单增李斯特菌进入VBNC状态的作用,发现在缺营养、9%(w/v)NaCl,2℃,pH6.0的条件下可以成功诱导单增李斯特菌进入VBNC状态,其中低温是成功诱导的重要条件。PMA-qPCR作为新型活菌检测技术,可以有效、准确地区分活的单增李斯特菌,在含有死菌的背景下实现对活菌的快速定量检测。该方法克服了传统qPCR法假阳性的缺点,能有效识别活菌(包括VBNC菌),为致病菌活菌检测提供新的方向。

[1]Peiris W I P.Listeriamonocytogenes,a food-borne pathogen[D]. Uppsala:Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science,Swedish University of Agricultural Sciences,2005.

[2]Bajard S,Rosso L,Fardel G,etal. The particular behaviour ofListeriamonocytogenesunder sub-optimal conditions[J]. International Journal of Food Microbiology,1996,29(2):201-211.

[3]Oliver J D. The viable but nonculturable state in bacteria[J]. J Microbiol,2005,43(1):93-100.

[4]Oliver J D,Nilsson L,Kjelleberg S. Formation of nonculturableVibriovulnificuscells and its relationship to the starvation state[J]. Applied and Environmental Microbiology,1991,57(9):2640-2644.

[5]Baffone W,Citterio B,Vittoria E,etal. Retention of virulence in viable but non-culturablehalophilicVibriospp[J]. International Journal of Food Microbiology,2003,89(1):31-39.

[6]Zhao F,Bi X,Hao Y,etal. Induction of Viable but NonculturableEscherichiacoliO157∶H7 by High Pressure CO2and Its Characteristics[J]. PloS One,2013,8(4):e62388.

[7]Oliver J,Dagher M,Linden K. Induction ofEscherichiacoliandSalmonellatyphimuriuminto the viable but nonculturable state following chlorination of wastewater[J]. J Water Health,2005,3:249-257.

[8]鲁梅芳,金玉妍.金黄色葡萄球菌活的非可培养状态的诱导和检出[J].环境与健康杂志,2009,26(10):877-879.

[9]Lai C J,Chen S Y,Lin I,etal. Change of protein profiles in the induction of the viable but nonculturable state ofVibrioparahaemolyticus[J]. International Journal of Food Microbiology,2009,135(2):118-124.

[10]余以刚,田聪,肖性龙,等.金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导条件和EMA—qPCR检测[J].华南理工大学学报:自然科学版,2013(1):127-132.

[11]Besnard V,Federighi M,Declerq E,etal. Environmental and physico-chemical factors induce VBNC state inListeriamonocytogenes[J]. Veterinary Research,2002,33(4):359-370.

[12]Dreux N,Albagnac C,Federighi M,etal. Viable but non-culturableListeriamonocytogeneson parsley leaves and absence of recovery to a culturable state[J]. Journal of Applied Microbiology,2007,103(4):1272-1281.

[13]Cunningham E,O’Byrne C,Oliver J D. Effect of weak acids onListeriamonocytogenessurvival:Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH[J]. Food Control,2009,20(12):1141-1144.

[14]Nogva H K,Dromtorp S M,Nissen H,etal. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR[J]. Biotechniques,2003,34(4):804-813.

[15]Boulos L,Prevost M,Barbeau B,etal. LIVE/DEAD® Bac LightTM:application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water[J]. Journal of Microbiological Methods,1999,37(1):77-86.

[16]Baena-Ruano S,Jiménez-Ot C,Santos-Dueas I M,etal. Rapid method for total,viable and non-viable acetic acid bacteria determination during acetification process[J]. Process Biochemistry,2006,41(5):1160-1164.

[17]Vattakaven T,Bond P,Bradley G,etal. Differential effects of temperature and starvation on induction of the viable-but-nonculturable state in the coral pathogensVibrioshiloiandVibriotasmaniensis[J]. Applied and environmental microbiology,2006,72(10):6508-6513.

[18]Nocker A,Sossa-Fernandez P,Burr M D,etal. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology[J]. Applied and Eironmental Mcrobiology,2007,73(16):5111-5117.

Induction and PMA-qPCR detection ofListeriamonocytogenesin viable but non-culturable state

HUANGYun1,YUYi-gang1,HUANGXin-li2,LIXiao-feng1,XIAOXing-long1,*,WUHui1

(1.College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China; 2.Huizhou Quanlity and Measuring Superrision Testing Intitute,Huizhou 516000,China)

Under the condition of 9%(w/v)NaCl,the induction of “viable but non culturable”(VBNC)Listeriamonocytogeneswas undertaken by investigating two factors,temperature and pH. In order to compare the changes of bacteria state and numbers caused by different inducing conditions,the LIVE/DEAD® BacLightTMBacterial Viability Kit was used for enumeration of total cells and viable cells. The results showed that all viableListeriamonocytogeneswere induced into the VBNC state at 2℃,pH6.0. PMA-qPCR was proposed to detect theListeriamonocytogenesexperienced different inductions. It was indicated that PMA-qPCR was an effective method to detect viableListeriamonocytogeneseven if undering the dead cells background.

VBNC;PMA;Listeriamonocytogenes;viable cells;detection

2013-07-11 *通讯联系人

黄韵(1988-)，女，硕士，主要从事食品安全与检测研究。

国家自然科学基金青年科学基金资助项目(31101279)；国家自然科学基金面上资助项目(31271867)；教育部高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题(20110172120034)；华南理工大学中央高校基本科研业务费重点项目(2013ZZ068)；惠州市科技计划项目(0031939140712048)；广东省科技计划资助项目(2011B020314004)；2013年华南理工大学百步梯攀登计划项目资助(DC30913001)。

TS207.4

：A

：1002-0306(2014)01-0137-05