基于Hg2+诱导DNA双链形成的汞离子检测试纸条研制*

杜 娟, 娄新徽, 金庆辉, 赵建龙

(1.中国科学院 上海微系统与信息技术研究所 传感技术联合国家重点实验室，上海200050；

2.首都师范大学，北京 100048； 3.中国科学院大学，北京100049)

0 引 言

Hg是一种高毒性的全球环境污染物，由于其具有高迁移性、不可降解性、生物富集性和食物链放大性的特点，即便是极微量的存在于环境中，也会对动植物和人类的健康造成极大的威胁[1, 2]。Hg以多种形式存在于环境中，水溶性的Hg2+是汞污染最常见和最稳定的形式之一。传统的Hg2+检测方法主要有：原子吸收法、原子荧光法、高效液相色谱法以及电感耦合等。尽管能够得到比较精确的检测结果，但这些技术依赖大型仪器设备、耗费耗时、检测成本高，很难满足产地现场快速检测的要求[3]。随后又发展了一些基于有机发色团[4]、有机荧光小分子[5]以及共轭聚合物[6]的传感技术，相对于传统方法，这些方法具有简单、经济、快速的优势，但是却有水溶性差、灵敏度低、选择性局限的缺点。因此，人们迫切需要简便、快速、经济、准确的Hg2+检测分析方法。

近年来的研究表明[7, 8]，Hg2+能特异性地与2个胸腺嘧啶碱基(T)共价结合形成稳定的T-Hg2+-T结构。基于Hg2+的这一特性，已发展了各种检测方法，如纳米金比色法[9～14]、荧光分析法[8, 15～21]、电化学法[22～24]等。层析试纸检测技术是20世纪80年代初发展起来的一种快速检测技术，由于其具有快捷、灵敏、成本低廉等显著优点，在快速检测技术领域中被广泛应用。本文利用Hg2+与T形成T-Hg2+-T结构的这一特性，以层析试纸为检测平台，设计了一种可用于现场快速检测溶液中Hg2+浓度的检测试纸条，检测结果裸眼观察可见，并可通过金标条阅读仪进行分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

双维平面划膜仪和全自动斩切机(上海金标生物科技公司)；DGG—9053A型恒温干燥箱(韩国Sumsung公司)；QimageRetiga 2000R数码相机(日本Olympus公司)；DJM—4金标条阅读仪(中国科学院上海光学精密机械研究所)；V—670紫外—可见分光光度计(美国Jasco公司)；JEM—21O0透射电子显微镜(TEM，日本电子公司)；Centrifuge5804R高速离心机(德国Eppendorf公司)。

纳米金溶液由本实验室自行制备；金标稀释液(30 %蔗糖，0.25 %吐温20，0.25 % SDS，pH=7.2)；MOPS缓冲液(100 mmol/L NaNO3, 10 mmol/L MOPS,pH=7.2)；DNA探针由上海生物工程技术有限公司合成(见表1)；二水合双(对—磺酰苯基)苯基膦化二钾盐(bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphinedihydratedipotassium，BSPP)、三(2—羧乙基)膦盐酸盐(Tris(2—carboxyethyl)phosphine hydrochloride，TCEP)、3—吗啉代丙磺酸(3—(N-morpholino) propanesulfo-nic，MOPS)均购自美国Sigma-Aldrich公司；链亲和素(美国New England Biolabs公司)；标准汞储存液(美国AccuStandard公司)；其它试剂为分析纯。

层析试纸条材料：结合垫(SB06玻璃纤维)、样品垫、硝酸纤维素膜(180 s)、吸水垫(CH27吸水纸)和聚氯乙烯(PVC)背板、塑料外壳均购于上海快灵生物科技公司。

表1 核酸探针序列

1.2 实验方法

1.2.1 纳米金颗粒的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备直径约为13 nm的纳米金颗粒溶胶。待用玻璃器皿和磁力搅拌子用王水(HCl∶HNO33∶1)浸泡并用去离子水冲洗干净，置于烘箱内直至干燥。将250 mL的1 mmol/L的四氯金酸(HAuCl4)溶液均匀加热至沸腾10 min。在高速搅拌下快速加入38.8 mmol/L的柠檬酸三钠溶液25 mL，继续加热搅拌15 min。停止加热后继续搅拌，自然冷却至室温。经0.22 μm滤膜过滤后，4 ℃下保存备用。

1.2.2 纳米金探针的标记

将10 mL的13 nm的纳米金原液与20 mg BSPP混合，摇床剧烈震动过夜，加入5 mol/L NaNO3直至纳米金变成蓝色，将混合溶液在25 ℃，13 000 rpm，15 min离心至纳米金颗粒完全凝聚，弃上清，加入5 mL的 mg/mL BSPP水溶液，4 ℃保存备用。将6 μL的1 mol/LTCEP溶液加入600 μL的5 μmol/L巯基修饰的检测探针溶液(PB缓冲液)中混合均匀，室温放置30 min，后加入600 μL制备好的BSPP—纳米金溶液，混匀后在4 ℃冰箱内静止16 h，逐步分次加入1 mol/L NaNO3,10 mmol/L PBS直至最终混合溶液Na+浓度达到150 mmol/L，在4 ℃冰箱内静止48 h，放入离心机在4 ℃，9 000 rpm，50 min离心，弃上清，加入150 mmol/L NaNO3和10 mmol/L PBS重复洗脱2次，最后储存于金标稀释液中。

1.2.3 捕获探针的制备

将100 μmol/L生物素修饰的捕获探针溶液(Probe1/2/3)分别与1 g/L链亲和素等体积混合，室温静止1 h后作为捕获探针备用。

1.2.4 试纸条的制作

用双维平面划膜仪将捕获探针以1 μL/cm的浓度分别固定在NC膜上，间隔为5 mm，作为检测线T1,T2和控制线C，干燥后封闭备用；用金标稀释液将纳米金探针稀释后喷涂在结合垫上，37 ℃干燥过夜。在PVC背板上依次粘贴硝酸纤维素膜(NC膜)、结合垫、样品垫和吸水垫，然后用全自动斩切机切成宽度为3.5 mm的试纸条，压入塑料外壳中，密封干燥保存。

1.2.5 灵敏度与选择性测试

在MOPS缓冲液中标准添加Hg2+原液，配置不同浓度的Hg2+溶液，将50μL Hg2+溶液加入试纸条加样孔，水平静止5 min，待纳米金探针完全由结合垫迁移至吸收垫，即可用观察条带颜色变化，然后将试纸条放入DJM—4金标条阅读仪进一步分析检测结果。

在MOPS缓冲液中标准添加常见二价重金属离子，配制Cu2+,Ni2+,Mg2+,Zn2+,Pb2+溶液用于选择性测试。

1.2.6 饮用水中的Hg2+检测

饮用水来源于实验室，在饮用水中标准添加一定量的Hg2+原液，配制不同浓度的Hg2+溶液，将检测结果与MOP缓冲液中Hg2+检测结果对照。

1.2.7 稳定性测试

将制备好的试纸条置于室温放置的干燥器中，分别在第1,2,4,8周取出测定，观察条带的颜色和试纸条的灵敏度的变化。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

本研究旨在构建一种灵敏快速的试纸条，用于现场检测溶液中Hg2+浓度。该试纸主要由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜以及吸收垫四部分组成，包含2条测试线T1,T2和1条控制线C，试纸条结构如图1(a)所示。探针序列设计见表1。根据检测序列，标记在纳米金上的AuNP Probe中的一段序列(A20)与测试线T1捕获探针Probe1完全互补，Probe1为寡核酸链T20，对Hg2+具有识别作用。检测探针另一段序列与控制线C捕获探针Probe2完全互补，同时与测试线T2捕获探针Probe2构成对Hg2+具有特异性的识别探针。检测原理如图1(b)所示，当待测样品中无Hg2+存在时，纳米金探针被Probe1和Probe3捕获，T1线和C线显红色。当待测样品中存在Hg2+时，介导T—T错配形成比A-T稳定的T-Hg2+-T结构，Probe1自身形成双链结构而导致捕获的纳米金探针量减少，T1线颜色变淡至消失；Probe2在Hg2+的介导作用下捕获纳米金探针，T2线显红色并随Hg2+浓度提高颜色加深；Probe3捕获纳米金探针不受Hg2+影响，C线始终显红色，指示试纸条是否正常工作。

图1 试纸条结构示意图和Hg2+检测原理图

2.2 纳米金探针制备与分析

将制备好的纳米金溶液用透射电子显微镜(TEM)观察，其结果如图2所示，制备的纳米金粒子平均粒径为13±3 nm，大小均匀，形态稳定。

图2 纳米金溶液TEM图像

纳米金原液与纳米金探针经紫外—可见分光光度计扫描，图3(a)显示纳米金原液A在520 nm波长附近有最大吸收峰，BSPP纳米金(B)最大吸收峰在522 nm处，而标记了单链DNA后的纳米金探针C最大吸收峰在525 nm处，较原液红移了约5 nm。图3(b)所示为琼脂糖电泳图，纳米金原液A聚集在点样孔并在电泳液中盐离子浓度下发生聚集而变蓝；BSPP纳米金B稳定性增强，未发生聚集，有明显条带；标记了单链DNA的纳米金探针C由于DNA的牵制导致其电泳速率比BSPP纳米金缓慢。综上所述，单链DNA标记纳米金探针是成功的。

图3 紫外—可见吸收谱和琼脂糖电泳图

2.3 标准缓冲液中Hg2+检测结果

用试纸条分别对MOPS缓冲液中浓度为0,0.1,1,10,100 μmol/的Hg2+进行检测，结果分别如图4(a)所示，T1线颜色随Hg2+浓度升高而减弱直至消失，T2线颜色随Hg2+浓度升高增强，裸眼可见检测灵敏度约为100 nmol/L。用DJM—4金标条阅读仪分析检测结果，以测试线与控制线信号强度比值(T1/C，T2/C)作为衡量标准，绘制曲线如图4(b)所示，可见该试纸的检测结果在10 nmol/L～10 μmol/L范围内具有较好的线性关系。

图4 试纸条检测缓冲液中不同浓度Hg2+结果和信号—浓度曲线图

2.4 对其他重金属离子的选择性

用试纸条分别对MOPS缓冲液中1 μmol/L的Cu2+,Ni2+,Mg2+,Zn2+,Pb2+以及Hg2+进行检测，检测结果照片和金标条阅读仪扫描信号分别如图5(a)和图5(b)所示，可见该试纸对常见二价重金属离子具有良好的选择性。

图5 试纸条检测1 μmol/L Cu2+,Ni2+,Mg2+,Zn2+,Pb2+,Hg2+结果图和信号对比

2.5 饮用水中的Hg2+检测结果

用试纸条分别对饮用水中浓度为0,0.1,1,10,100 μmol/L的Hg2+进行检测，结果分别如图6(a)所示。分别取0,1,100 μmol/L饮用水中Hg2+检测结果与MOPS缓冲液中Hg2+检测结果对比，金标条阅读仪器分析结果如图6(b)所示，检测结果基本无差别，因此,该试纸可用于饮用水中的Hg2+快速检测。

图6 试纸条检测饮用水中不同浓度Hg2+检测结果图和缓冲液与饮用水中Hg2+检测信号对比图

2.6 试纸条稳定性测试结果

分别在试纸条制备的第1,2,4,8周从干燥箱内取出试纸进行重复实验，结果表明:在室温保存8周的试纸条，条带颜色和检出限与新制备的试纸条没有明显差异，说明在室温干燥条件下，该试纸条至少可保存2个月。

3 结 论

本文成功研制出一种可用于现场快速检测的汞离子检测试纸条，检测结果在5 min内显示，裸眼可见灵敏度约为100 nmol/L，金标条阅读仪分析结果在10 nmol/L～10 μmol/L范围内具有较好的线性关系，对常见二价重金属离子具有良好的选择性。与传统汞离子检测方法相比，该方法快捷灵敏、操作简单、成本低廉、易于存放，在环境监测、食品安全等方面具有很好的应用前景。

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