超高压处理对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响

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(合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥 230009)

超高压处理对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响

葛梅,梁娟,潘见,孟飞龙,徐金凤,谢慧明*

(合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥 230009)

为保留菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性,探讨了超高压处理中压力、保压时间和温度对菠萝蛋白酶纤溶活性的影响,并考察其在模拟胃肠道环境中的稳定性。结果表明:压力、保压时间和温度均对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响显著,压力300MPa、温度30℃、保压10min时菠萝蛋白酶的纤溶活性比未处理样高65.54%；300MPa保压10min(30℃)处理的菠萝汁在模拟胃液和肠液各处理4h后,纤溶活性残留率分别为37.91%和85.33%,均高于鲜榨汁。说明,通过调整超高压处理条件,可以提高菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性及其对模拟胃肠液的耐受性。

超高压,菠萝蛋白酶,纤溶活性,胃肠道消化液

栓塞性疾病严重危害人类的生命健康,尤其是心脑血管栓塞性疾病是危害中老年人健康最严重又常见的疾病之一[1]。从膳食成分中寻找和开发抗栓和溶栓的物质具有广泛的临床实用价值。

菠萝中含有的菠萝蛋白酶具有抗炎、抗肿瘤、抗血栓、溶解纤维蛋白、抗血小板聚集、增强抗生素效应和助消化等功能[2-4],其中抗血栓、抗肿瘤、抗炎及抗血小板聚集功能均与其纤溶功能有关[5-6]。纤维蛋白也是血栓的主要组成成分之一。菠萝蛋白酶在胃液中不稳定,临床上常用菠萝蛋白酶肠溶片,口服后能加强体内纤维蛋白的水解作用,将阻塞于组织的纤维蛋白及血凝块溶解,从而改善体液的局部循环,促使炎症和水肿的消除。

菠萝蛋白酶对热敏感,40℃以上条件下酶活半衰期在2h以内,热变性温度在55～60℃[7],传统的热加工方式易使其失活。食品超高压加工技术属于非热力杀菌,能在杀菌的同时最大程度地保留果蔬汁的香气成分、营养物质以及生物活性。关于超高压菠萝汁的研究[8-11]主要集中在以不同的杀菌方式获得的菠萝汁的杀菌效果、感官品质、理化指标的对比,对超高压菠萝汁的溶纤功能的研究目前鲜见报道。

超高压处理中,酶的活性不仅取决于压力的大小,同时与处理温度、保压时间和处理对象的化学组成有关系。本研究以菠萝汁中菠萝蛋白酶为对象,研究超高压处理压力、温度、保压时间对菠萝蛋白酶纤溶活性的影响,并探讨其消化性质,以期为功能菠萝汁超高压加工技术的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

市售菠萝(产地海南)七成熟 购自合肥周谷堆农产品批发市场。

凝血酶(酶活力62U/mg)、牛纤维蛋白原 购自sigma；尿激酶(酶活力1240U/支) 购自中国食品药品检定研究院；考马斯亮蓝R250、琼脂、胃蛋白酶(酶活力1∶3000)、胰酶(酶活力11*USP) 购自上海生工生物有限公司。

1L YCB630/2.5食品超高压设备(工作压力0～600MPa,工作温度0～50℃) 兵器工业第五二研究所国营七厂；JYZ-D520榨汁机 九阳股份有限公司；3K-15高速冷冻离心机 德国Sigma公司；DZ-400/2S真空包装机 浙江金华市包装机械有限公司；G-135电子天平 德国梅特勒-托利多公司；SHP-250恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司；HH恒温水浴锅 金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1 试样的制备 菠萝→去皮、去目、切端→清洗、切块→榨汁→4层纱布过滤→均质→真空脱气5min→灌装→超高压处理→检测

所制菠萝汁样品存放于4℃冰箱内,在12h内完成超高压处理。

1.2.2 超高压处理 所制菠萝汁用聚乙烯塑料袋真空密封包装2层(不留顶隙,15mL/袋),按照实验设计,设定压力、温度和保压时间3个参数进行超高压处理。进行温度因素考察时需提前调节高压容器外夹套中介质温度使容器中介质到达要求温度后,将试样浸没此传压介质中1min后再升压。

处理后的样品存放在4℃冰箱里,在24h内完成检测。所有数据均为3个试样测定后的平均值。受实验条件的限制,无法一次性完成所有菠萝汁样品的制备、处理和检测,单因素实验和正交实验所用菠萝汁样品批次不同。

1.2.3 超高压单因素实验

1.2.3.1 压力的选择 菠萝汁pH3.70、处理温度20℃、保压时间10min的条件下,进行处理压力为100、200、300和400MPa的超高压处理,研究压力对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响。平行测定3次,以未经超高压处理菠萝汁(以下简称原样)中菠萝蛋白酶的纤溶活性作为参照(100%),菠萝汁中菠萝蛋白酶的相对纤溶活性为指标。

1.2.3.2 保压时间的选择 pH3.70的菠萝汁在处理温度20℃、单因素压力较优条件下,进行保压时间分别为5、10、15、20、25min的超高压处理,考察保压时间对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响。平行测定3次,以原样中菠萝蛋白酶的纤溶活性作为参照(100%),菠萝汁中菠萝蛋白酶的相对纤溶活性为指标。

1.2.3.3 温度的选择 在常压条件下和超高压单因素较优压力和较优保压时间条件下分别对pH3.70的菠萝汁进行5种不同温度(10、20、30、40、50℃)的处理实验,研究常压和超高压条件下温度对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响。平行测定3次,以原样中菠萝蛋白酶的纤溶活性作为参照(100%),菠萝汁中菠萝蛋白酶的相对纤溶活性为指标。

1.2.4 正交实验优化 根据单因素实验结果,选取压力、保压时间和处理温度3个因素,每个因素设计3个水平,以菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性为考察指标,按照L9(34)正交表进行实验。正交实验因素及水平设置如表1所示。

表1 超高压处理正交实验因素及水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal experiment

1.2.5 纤溶活性的测定 采用纤维平板法[12-13]并稍作修改测定菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性。

1.2.5.1 纤维蛋白平板的制备 用PBS配制10g/L的琼脂溶液,加热使其完全融化后取15mL放入烧杯中,冷却至50℃时加入10g/L纤维蛋白原溶液0.5mL和100U/mL的凝血酶溶液20μL,快速混匀后倒入9cm的皮氏平皿中。室温下放置1h以形成纤维蛋白凝块。

1.2.5.2 尿激酶标准曲线的制作 用PBS溶液(pH7.4)将尿激酶标准品稀释成20、30、40、50、100、150、200、250U/mL 8个浓度。用直径3mm的打孔器在新制备的纤维蛋白平板上打孔,然后向其中加入10μL的上述不同浓度的尿激酶溶液,室温放置10min后37℃培养18h,用考马斯亮蓝染色液染色(考马斯亮蓝R250 0.1%,甲醇12%,冰乙酸10%)15min,然后用脱色液(甲醇20%,冰乙酸8%)脱色至能看见清楚的裂解圈为止。用游标卡尺测量裂解圈相互垂直的两条直径值,计算两条直径的乘积作为裂解圈的面积,重复测定3次求平均值。以尿激酶活力单位数C(U/mL)的对数log C为横坐标,裂解圈的面积A(mm2)的对数值log A为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.5.3 试样纤溶活性的测定 取待测菠萝汁样品于4℃离心10min(6000×g),弃去沉淀,取上清液10μL点样于纤维蛋白平板样孔中,按上述方法进行操作,测定裂解圈的直径后取平均值,根据尿激酶标准曲线求出样品的纤溶活性。

1.2.6 模拟胃液对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响 模拟胃液[14]:称取0.2g NaCl和0.13g胃蛋白酶,加入70mL重蒸馏水,用HCl调pH至1.2,加水定容至100mL。现用现配。

在10mL离心管中加入1.9mL模拟胃液,37℃恒温水浴预热5min。加入500μL待测菠萝汁样品,迅速混匀后置于37℃水浴中,准确记录时间,分别在反应15、30、60、120、180、240min后取出100μL反应液于1.5mL离心管中,速置于冰浴中存放。以1.9mL重蒸馏水加500μL菠萝汁作为试样对照。另取10mL离心管加入1.9mL模拟胃液和500μL重蒸馏水作为模拟胃液对照。各取样10μL测定反应前后的纤溶活性。

1.2.7 模拟肠液对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响 模拟肠液[14]:称取0.7g KH2PO4溶于25mL重蒸馏水中,搅拌使之完全溶解,加入19mL 0.2mol/L NaOH和40mL重蒸馏水,再加入0.09g胰酶,用0.2mol/L NaOH调pH至7.5,加重蒸馏水定容至100mL。现用现配。

在10mL离心管加入1.9mL模拟肠液,37℃恒温水浴预热5min。加入200μL待测菠萝汁样品,迅速混匀后速置37℃水浴中,准确记录时间,分别在反应15、30、60、120、180、240min后取出100μL反应液于1.5mL离心管中,速置于冰浴中存放。以1.9mL重蒸馏水加200μL菠萝汁作为试样对照。另取10mL离心管加入1.9mL模拟肠液和200μL重蒸馏水作为模拟肠液对照。各取样10μL测定反应前后的纤溶活性。

1.3数据处理与分析

所得数据均采用origin8.0和SPSS19.0进行处理分析。

2 结果与分析

2.1压力对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响

超高压处理压力对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响如图1所示。原样中菠萝蛋白酶的纤溶活性为252.89±11.24U/mL。由图1所示,压力100MPa时,菠萝蛋白酶的纤溶活性比原样高10.43%,随着压力的升高,超高压菠萝汁中菠萝蛋白酶的相对纤溶活性先增大后减小,于300MPa压力时达到最大值173.83%。方差分析结果显示,超高压处理压力对菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性影响极显著(p<0.01)。由此可知,处理压力小于300MPa时,增大压力有助于提高菠萝蛋白酶的纤溶活性,其原因主要有以下3个方面:a.在完整组织中酶和底物经常被膜隔离,较低的高压处理可以破坏这种膜,使酶和底物相互接触,从而引起酶促反应的发生。b.超高压处理可使蛋白质分子结构中暴露更多的巯基基团[15],菠萝蛋白酶属于半胱氨酸巯基蛋白酶,巯基是其催化活性的必须基团之一[16],巯基含量的增加使菠萝蛋白酶的纤溶活性增加。c.α-螺旋结构对菠萝蛋白酶的稳定性起关键作用,酶活性降低时α-螺旋减少[17],而压力较低时酶蛋白二级结构的α-螺旋和β-折叠不被压缩,甚至还会更加稳定[18]。

图1 压力对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响Fig.1 Effect of pressure on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

压力高于300MPa时,菠萝蛋白酶的纤溶活性开始下降,但400MPa压力下菠萝蛋白酶的纤溶活性仍比原样高20%左右,这与陶敏等[19]报道的400MPa条件下菠萝蛋白酶的相对酶活下降10%有所不同,可能是由于菠萝蛋白酶作用于不同底物时的最小钝化压力不同,亦或菠萝蛋白酶对不同底物的作用方式也不同:陶敏等研究中的菠萝蛋白酶的酶活系针对水解酪蛋白的活性；而菠萝蛋白酶的纤溶活性除来自直接降解纤维蛋白外,还可通过激活纤维蛋白溶酶原转变为纤溶酶来降解纤维蛋白[5]。

2.2保压时间对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响

保压时间对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响如图2所示。由图2可见,300MPa压力下,随着保压时间的延长,菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性先增加后减少,但均高于未处理样品。保压10min时,菠萝蛋白酶的相对纤溶活性达到最大值163.24%。对五种保压时间进行方差分析结果显示,超高压处理时保压时间对菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性影响显著(p<0.05)。保压时间大于15min后,菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性增加趋势缓慢趋于平衡,此时保压时间不再是影响纤溶活性的主要因素。

图2 保压时间对菠萝蛋白酶纤溶活性的影响Fig.2 Effect of holding time on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

2.3温度对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响

图3可见,常压下,10～50℃温度范围内,菠萝汁中菠萝蛋白酶的相对纤溶活性随着温度的升高有所升高,在50℃时达到最高(115.33%)。而在300MPa压力下,菠萝汁中菠萝蛋白酶的相对纤溶活性随着温度升高呈先升高后下降趋势,在40℃时达到最大值(150.71%),且不同温度(10～50℃)协同超高压处理对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性影响显著(p<0.05)。在10～40℃温度范围内,经300MPa处理的菠萝汁中菠萝蛋白酶的相对纤溶活性均高于常压下的对应值,可见在此温度范围内超高压处理有助于提高菠萝蛋白酶的纤溶活性。这是因为在酶分子体系中,压力和温度对酶分子排列和空间构象存在拮抗关系,在一定的温度和压力范围内增大压力对酶起稳定作用[18]。当温度达到50℃时,温度协同超高压作用又促使菠萝蛋白酶变性,则纤溶活性显著降低。

图3 温度对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响Fig.3 Effect of temperature on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

2.4超高压正交实验结果

按表1的设计进行正交实验,测定结果如表2所示。方差分析结果如表3所示。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交实验方差分析结果Table 3 Analysis results of variance

由表2、表3可见,各因素对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响大小的顺序依次为:压力>温度>保压时间。其中,压力对菠萝蛋白酶的纤溶活性影响显著,而温度和保压时间较不显著。极差分析得出的最佳工艺组合为A2B1C3,即压力300MPa,保压时间10min,温度40℃；而直观分析得出的最佳组合为A2B1C2,即压力300MPa,保压时间10min,温度30℃。选择A2B1C2和A2B1C3进行验证实验发现2种工艺组合测得的菠萝蛋白酶的纤溶活性差别不大,考虑到较低的处理温度不仅能节约加工成本还可更多地保留菠萝汁中的其他活性成分,选取压力300MPa,保压时间10min,温度30℃作为保留菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的最佳超高压处理条件。按此条件进行超高压处理,菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性可达428.74U/mL,比原样高65.54%。

2.5模拟胃液对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响

将原样和300MPa保压10min(30℃)处理的菠萝汁在模拟胃液中作用不同时间后,菠萝蛋白酶的纤溶活性变化趋势如图4所示。

图4 模拟胃液对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响Fig.4 Effect of simulated gastric juice on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

将各样品点样于纤维蛋白平板后发现,模拟胃液不分解纤维蛋白。由图4可知,随着反应时间的延长,原样和超高压处理的菠萝汁中菠萝蛋白酶的残余纤溶活性均呈下降趋势。反应4h后,超高压处理的菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性残留率为37.91%,比原样高25.92%。可见菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性在模拟胃液中的损失较大。这是因为菠萝蛋白酶的最适pH接近中性,pH为1.2的模拟胃液会降低其活性,也有可能这种低pH使得菠萝蛋白酶酶聚集,一些活性基团被埋没在分子内部。此外胃蛋白酶对其也有分解作用。但是经超高压处理的菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性损失较慢,且残留率高于原样。这与较低的高压处理下酶蛋白的二级结构更加稳定有关[18]。

2.6模拟肠液对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响

纤溶活性测定结果显示,模拟肠液对照可以溶解纤维蛋白,其纤溶活性为879.94±22.52U/mL,原样和300MPa保压10min(30℃)处理的菠萝汁在模拟肠液中作用不同时间后菠萝蛋白酶纤溶活性变化趋势如图5所示。

图5 模拟肠液对菠萝汁中菠萝蛋白酶纤溶活性的影响Fig.5 Effect of simulated intestinal juice on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

由图5可知,随着反应时间的延长,原样和超高压处理的菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性均呈缓慢下降趋势,且经超高压处理的菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性残留率高于原样。反应4h后,超高压处理的菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性残留率为85.53%,比原样高11.2%。统计分析显示模拟肠液对菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性无显著影响(p>0.25),说明菠萝蛋白酶在小肠环境中较稳定,胰酶对其影响很小,且经过超高压处理的菠萝汁中菠萝蛋白酶对模拟肠液的耐受性提高。

本研究中模拟胃肠液的配制及其与目的蛋白的比例参照农业部869公告中的规定,而目前关于目的蛋白与模拟胃肠液的比例并没有统一的标准,各个实验室进行模拟胃液消化的胃酸pH也从1.2～3.5不等[20]。为了能更真实准确的反应超高压处理对菠萝汁中菠萝蛋白酶消化稳定性的影响,需要更进一步的研究。

3 结论

采用超高压加工鲜榨菠萝汁时,压力、保压时间和温度均对菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性影响显著,30℃、300MPa加压10min时菠萝蛋白酶的纤溶活性可达428.74U/mL,比鲜榨汁高65.54%。超高压处理不仅能提高菠萝汁中菠萝蛋白酶的纤溶活性,而且300MPa加压10min(30℃)处理的菠萝汁中菠萝蛋白酶对模拟胃肠液的耐受性提高,其在模拟胃液和和模拟肠液中各作用4h后纤溶活性残留率分别为37.91%和85.33%,均高于鲜榨汁。

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Effect of ultra-high pressure treatment on fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice

GEMei,LIANGJuan,PANJian,MENGFei-long,XUJin-feng,XIEHui-ming*

(Engineering Research Center of Bio-process,Ministry of Education,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

To preserve fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice,the effect of different pressures,temperatures and pressure holding times on the fibrinolytic activity of bromelain was investigated. Stability of bromelain in simulated gastrointestinal digestive fluid were also studied. Results showed that all the factors had significant effects on fibrinolytic activity of bromelain. At 300MPa(30℃,10min),the fibrinolytic activity of bromelain was 65.54% higher than that of fresh pineapple juice. After 4h incubation in simulated gastric fluid or intestinal fluid at 300MPa(10min,30℃),the residual fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice was 37.91% or 85.33%,respectively,which were both higher than that of fresh pineapple juice. It indicated that ultra high pressure treatment could improve the fibrinolytic activity of bromelain in pineapple juice and its tolerance to simulated gastrointestinal fluid by adjusting the processing parameters.

ultra-high pressure;bromelain;fibrinolytic activity;gastrointestinal digestive fluid

2014-01-17 *通讯联系人

葛梅(1989-),女,硕士研究生,研究方向:农产品现代加工技术与装备。

国家“863”计划项目(2011AA100801-05)。

TS255.1

A

1002-0306(2014)17-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.001