紫外诱变选育秦巴山区黑木耳耐高温菌株的研究

王 进， 陈文强，2

(1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723000;2.陕西理工学院陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中 723000)

紫外诱变选育秦巴山区黑木耳耐高温菌株的研究

王 进1， 陈文强1，2

(1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中 723000;2.陕西理工学院陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中 723000)

以秦巴山区黑木耳主要栽培菌株为材料，采用不同紫外照射时间和温度梯度筛选高温黑木耳品种。结果表明，黑木耳原生质体紫外诱变的最佳时间为120～180 s，再生菌落的致死率为64% ～82%，通过40℃高温初步筛选得到适合秦巴山区栽培的黑木耳菌株YBZ4。

黑木耳; 原生质体; 紫外诱变; 筛选; 高温

0引言

黑木耳(Auricularia auricula)又称木耳、细木耳、光木耳、云耳，分类上属层菌纲，木耳目，木耳科，木耳属(Auricularia)。木耳属食用菌不仅含有极高的营养价值和药用价值，同时热量很低，是一种健康美味食药用菌［1］。同时，因为黑木耳中含有丰富的纤维素和一种特殊的植物胶质，可助胃肠蠕动，减少脂肪吸收，是一种美容养生的绿色食品。由于秦巴山区气候温和湿润，很适宜菌类的生长，所产黑木耳以其质厚和肉嫩而深受人们喜爱。

原生质体紫外诱变技术应用于食用菌的育种中已有广泛报道，是目前食用菌高产新菌株选育和改善品种性状的重要方法之一。2008年，于兰芳［2］利用紫外线辐照细刺猴头菌菌丝，获得适合我国北方栽培的优良猴头菌新菌株;2009年，孙金旭等［3］利用原生质体紫外诱变技术，对灵芝进行了紫外诱变处理，得到比原始菌株更优秀的稳定高产的新菌株;2010年，朱蕴兰等［4］利用冬虫夏草原生质体为材料，经紫外诱变获得了性状优于出发菌株的突变株;2011年，王谦等［5］利用紫外线对大球盖菇原生质体的诱变效应进行了探究，选取35 s为最佳诱变照射时间，致死率是73.33%;2012年，张晓等［6］利用原生质体诱变育种技术选育富硒能力强的血芝优良菌株;2013年，白胡木吉力图等［7］通过对杏鲍菇菌株的担孢子收集、紫外诱变及突变菌株的出菇性能和抗杂能力测试试验，从28个突变菌株中筛选出1株有潜力的菌株。

目前，秦巴山区紫外诱变黑木耳菌株选育新品种尚无相关报道。本试验从7株秦巴山区黑木耳主要栽培种中选取1株黑木耳作为紫外诱变的亲本，通过不同紫外照射时间诱变选育适合秦巴山区栽培的耐高温的优良菌株。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

新科、耳268、秦单4#、耳2、耳913、神农A8、耳97—2共7株黑木耳栽培菌株，由陕西省资源生物重点实验室食药用菌菌种保藏中心提供。

1.1.2 培养基

CPDA 综合培养基:马铃薯 200.0 g，葡萄糖 20.0 g，蛋白胨 3.0 g，KH2PO45.0 g，MgSO4·7H2O 3.0 g，VB10.01 g，琼脂20.0 g，加水至1 000 mL;液体培养基为 CPDA 综合培养基(无琼脂);原生质体再生培养基(Regeneration Medium，RM)为CPDA综合培养基+109.3 g甘露醇。

1.1.3 主要试剂

试验主要的试剂有甘露醇、溶壁酶、酒精等。

1.1.4 主要仪器与设备

恒温振荡器(ZHWY-210 2C，上海智诚分析仪器制造有限公司)，超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)，电子天平(BJ100M，上海精科天美科学仪器有限公司)，立式圆形压力蒸汽灭菌器(LS-B50L，上海医用核子仪器厂)，人工气候箱(LRH-800-GS，韶关市明天环保仪器有限公司)，恒温水浴锅(DZKW-S-4，惠州市新旭实业有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 菌种活化

配制CPDA培养基，分装试管，于1.034×105Pa灭菌30 min后放置斜面，冷却后，7个黑木耳菌株分别接于培养基上，28℃培养，待菌丝长满斜面后转入4℃冰箱保存，备用。

1.2.2 菌丝生长速度的测定

配制CPDA培养基，于1.034×105Pa灭菌30 min，倒平皿，冷却后每个菌株接3个平皿，28℃培养，记录菌丝生长速度。

1.2.3 菌丝培养

向长满黑木耳菌丝的试管菌种中加入5.0 mL液体培养基，用接种针刮去菌种表面全部菌丝，将此带有菌丝的培养液倒入装有40.0 mL液体培养基的三角瓶中，28℃静置培养5～9 d，每天轻摇几次。

1.2.4 菌丝收集

无菌条件下用尼龙网布过滤收集菌丝体，无菌水冲洗一次，无菌滤纸吸干水分，再用稳渗剂冲洗，4℃条件下5 000 r/min离心10 min，去掉上清，重复一次。

1.2.5 原生质体的制备

向装有菌丝的离心管中分别添加1.5 mL溶壁酶液，震荡2 min混匀，在30℃水浴中酶解3.5 h，每隔一段时间震荡混匀一次［8］。

1.2.6 紫外诱变

超净工作台开启紫外灯预照射20～30 min，使波长稳定。取适当稀释倍数的原生质体悬液，设3次重复，置于15 W紫外灯下30 cm处分别照0、30、60、90、120、150、180 s，照射结束后分别涂布于固体再生培养基上，28℃培养10～15 d。

1.2.7 耐高温菌株的筛选

将诱变的黑木耳菌株分别接种到CPDA平板培养基上，每个菌株设3次重复，40℃下分别培养24 h，再置于28℃适宜条件下恢复培养，培养7 d，测量菌丝的生长速度，淘汰其它耐高温能力差的菌株。

1.2.8 再生菌株鉴定

配制CPDA培养基，于1.034×105Pa灭菌30 min，倒平皿，冷却后，将再生菌株与亲本菌株接于平皿上，28℃培养，观察颉颃反应。

1.2.9 黑木耳多糖的测定

胞外多糖提取流程:将发酵液3 000 r/min离心沉淀，上清液直接进行真空蒸发，浓缩至原体积的1/5，之后进行乙醇分步沉淀，离心收集沉淀，烘干称重得胞外粗多糖。胞内多糖提取流程:将深层发酵好的黑木耳菌丝体过滤，洗净，称取一定量的湿菌丝体，按一定的料水比(质量比1∶4)加入自来水，用组织捣碎机将菌丝球捣碎，按照设计的工艺参数进行热水浴加热浸取。重复提取2次，每次结束时将提取液离心沉淀，上清液合并，浓缩后按胞外多糖的提取工艺进行［9］。

2 结果与分析

2.1 黑木耳亲本菌株的初步筛选

黑木耳菌株于CPDA培养基中，28℃培养，记录菌丝生长速度。不同菌株菌丝生长速度如表1。

表1 黑木耳亲本菌株菌丝的生长速度

表1结果表明，黑木耳亲本菌株秦单4#菌丝生长速度最快，为6.2 mm;耳268菌丝生长速度最慢，为4.3 mm;7个黑木耳菌株菌丝的平均生长速度为5.3 mm，所以选取秦单4#作为黑木耳亲本菌株进行紫外诱变。

2.2 黑木耳菌株原生质体紫外诱变时间的选择

取制备的原生质体悬液1.0 mL，分别照射0、30、60、90、120、150、180 s，然后取 200 uL 原生质体悬液涂布。平皿用黑布包裹后置于黑暗闭光的28℃恒温箱培养10～15 d后，计数。以照射时间为横坐标，再生菌落数为纵坐标，黑木耳原生质体紫外诱变剂量效应曲线结果如图1所示。

图1结果表明，黑木耳原生质体对紫外线比较敏感，随着照射时间的延长，菌落数急剧下降。照射时间为0 s时，菌落数为11;照射时间为180 s时，菌落数为2。张卉等［10］研究结果表明，当致死率在70% ～80%时，发生正向突变的几率高，本试验选择紫外线诱变最佳时间是120～180 s，致死率为64% ～82%。

2.3 黑木耳耐高温菌株的筛选

将诱变后的黑木耳菌株分别接种到CPDA平板培养基上，每个菌株设3次重复，在40℃下分别培养24 h，再置于28℃最适宜条件下恢复培养，培养7 d，并测量菌丝的生长速度，淘汰其它耐高温能力差的菌株，结果如图2和表2所示。

图2和表2结果表明，温度对黑木耳菌丝生长的作用非常明显，不同菌株对高温敏感性有较大差异。YBZ4菌株菌丝生长速度最快，YBZ2菌株生长速度最慢;YBZ4菌株菌丝色泽洁白，菌丝整齐。由此，初步筛选出YBZ4菌株为耐高温菌株。

图1 紫外照射时间对黑木耳菌株菌落数的影响

表2 不同诱变菌株经高温(40℃)处理24 h后恢复28℃培养菌丝的生长速度

2.4 黑木耳耐高温诱变菌株与亲本菌株的颉颃反应

耐高温诱变菌株YBZ4与亲本菌株接种于CPDA培养基中，28℃培养，10 d后观察菌丝的颉颃反应，结果如图3所示。

图2 YBZ4菌株

图3 诱变菌株与亲本菌株的颉颃反应

图3结果表明，黑木耳耐高温诱变菌株和亲本黑木耳菌株中间有明显的颉颃线，证明发生有颉颃反应发生。由此，可确定耐高温黑木耳诱变菌株在原生质体紫外诱变过程中发生了核遗传要素的变异。

2.5 黑木耳耐高温诱变菌株与亲本菌株多糖得率的比较

取上述黑木耳诱变株YBZ4连同秦单4#进行摇瓶发酵试验。采用水浴法分别测定其多糖含量，结果如表3所示。

表3 黑木耳耐高温诱变菌株和亲本菌株多糖含量的比较

由表3结果可知，黑木耳耐高温诱变菌株的胞内多糖和胞外多糖得率分别为6.65%、5.46%;亲本黑木耳菌株的胞内多糖和胞外多糖得率分别为5.82%、5.17%。耐高温黑木耳诱变菌株胞内多糖和胞外多糖得率分别是亲本黑木耳菌株的1.14倍、1.06倍，多糖得率优于亲本菌株。所以，初步鉴定YBZ4为高温优良菌株。

3 讨论

原生质体诱变技术一般能保持原有菌种的主要生物学性状特点，并且育种周期短，突变株生物学性状比较稳定，不易退化。因此，原生质体诱变育种方法已成为当前丝状真菌育种的一种主要方法［3］。本研究利用黑木耳秦单4#菌株作为出发菌株，采用0～180 s作为诱变时间，对菌株进行了紫外诱变处理，得出紫外线诱变最佳时间为120～180 s。

由于秦巴山区黑木耳主要采用温室大棚进行代料栽培，所以黑木耳适应温度的能力直接影响黑木耳的产量。本研究对诱变菌株进行高温筛选，初步获得适应40℃生长的黑木耳菌株。

本研究采用热水浸提法对黑木耳诱变菌株进行胞内多糖和胞外多糖的提取，得出诱变种的胞内多糖和胞外多糖得率分别为6.65%、5.46%;秦单4#的胞内多糖和胞外多糖得率分别为5.82%、5.17%。诱变种胞内多糖和胞外多糖得率分别是出发种的1.14倍、1.06倍，多糖得率优于亲本菌株。

经紫外诱变、高温筛选、颉颃反应及多糖测定试验，初步可以得到优势高温菌株，为秦巴山区黑木耳种质资源奠定了基础。但所得菌株是否适宜于秦巴山区栽培并表现出优质高产性状有待进一步研究。

［1］陈丽华，章克昌.8味中药对黑木耳发酵的影响［J］.食品与生物技术学报，2007，26(5):104-108.

［2］于兰芳.紫外线诱变猴头菌菌丝及变异菌株的筛选［D］.保定:河北农业大学，2008.

［3］孙金旭，朱会霞.灵芝紫外诱变育种研究［J］.中国酿造，2009，28(8):63-65.

［4］朱蕴兰，陈安徽，王陶，等.冬虫夏草原生质体诱变育种研究［J］.食品科学，2010，31(5):256-260.

［5］王谦，刘敏，张亚从.大球盖菇原生质体制备及紫外诱变［J］.河北大学学报:自然科学版，2011，31(4):413-417.

［6］张晓，董娜，田彦辉，等.原生质体紫外诱变选育富硒血芝优良菌株［J］.食品科技，2012，37(5):2-5.

［7］白胡木吉力图，白福林，钱丹珠，等.杏鲍菇紫外线诱变育种试验［J］.中国农业信息，2013，48(1):63-65.

［8］孙露.木耳属遗传多样性及原生质体育种的研究［D］.长春:吉林农业大学，2012.

［9］肖彩霞.黑木耳液体深层发酵的研究［D］.无锡:江南大学，2004.

［10］张卉，李长彪，陈明波，等.原生质体紫外诱变选育姬松茸新菌株［J］.微生物学杂志，2004，24(6):56-57.

［责任编辑:魏 强］

On breeding high temperature resistant Auricularia auricula strains suitable to Qinling-Bashan Mountain Areas by ultraviolet mutagenesis

WANG Jin1， CHEN Wen-qiang1，2
(1.School of Bioscience and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China;2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fung;Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China)

With the Auricularia auricula strains cultivated in Qinling-Bashan Mountain Areas，excellent strains are expected to be found out by ultraviolet mutagenesis method.Different ultraviolet radiating time and temperature gradients are adopted to select the excellent high temperature resistant Auricularia auricula strains.The best time for ultraviolet mutagenesis is 120 ～ 180 s，and the preliminary Auricularia auricula strains suitable to Qinling-Bashan Mountain Areas can be sorted out from the whole samples.The high temperature resistant Auricularia auricula strain which is suitable to Qinling-Bashan Mountain Areas is YBZ4.

Auricularia auricula; protoplast; ultraviolet mutagenesis; choose; high temperature

S646.6

A

1673-2944(2014)05-0046-05

2014-04-01

陕西省科学技术研究发展计划项目(2014K01-16-03);陕西省科技统筹创新工程计划项目(2012HBGC-20);陕西理工学院研究生创新基金资助项目(SLGYCX1309，SLGYCX1418)

王进(1988—)，男，陕西省礼泉县人，陕西理工学院硕士研究生，主要研究方向为微生物的资源开发利用;［通信作者］陈文强(1956—)，男，陕西省洋县人，陕西理工学院教授，硕士研究生导师，主要研究方向为微生物资源的保护与利用。