骨桥蛋白及其整合素β3受体在肺动脉高压大鼠心肌中的表达及意义

庞启明,李坤

(1.淄博市中心医院 儿科,山东 淄博 255000;2.山东省医学科学院附属医院 妇产科,山东 济南 250031)

骨桥蛋白及其整合素β3受体在肺动脉高压大鼠心肌中的表达及意义

庞启明1,李坤2

(1.淄博市中心医院 儿科,山东 淄博 255000;2.山东省医学科学院附属医院 妇产科,山东 济南 250031)

目的 观察骨桥蛋白及其整合素β3受体在肺动脉高压大鼠心肌中的表达变化及其与右心室重塑的关系，为研究其在心血管病理生理机制中的作用奠定基础。方法 60只SD大鼠分为5组，对照组和4个肺动脉高压实验组（PAH组)，实验组大鼠通过皮下注射野百合碱建立肺动脉高压模型，在注射后第1，2，3，4周的4个时间取材，命名为PAH1、PAH2、PAH3和PAH4组。测定各组大鼠平均肺动脉压（mPAP)和右心室肥厚指数；采用免疫组化、Western blot和RT-PCR法测定不同时间点各组大鼠右心室心肌骨桥蛋白（OPN)及其整合素β3受体mRNA的表达水平。结果 与对照组大鼠相比，肺动脉各高压组右心室心肌OPN与整合素β3表达均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05)，并随着肺动脉高压产生的时间延长而增高。相关性分析显示右心室肥厚指数与右心室心肌0PNmRNA表达水平呈明显正相关性（r=0.828，P＜0.01)，同时与右心室心肌整合素β3mRNA也呈明显正相关（r=0.822，P＜0.01)。结论 大鼠肺动脉高压及右室肥大形成过程中，右心室心肌OPN及其受体整合素β3基因表达增高，可能在右心室心肌重塑中起重要的作用。

骨桥蛋白；整合素β3；肺动脉高压大鼠模型

心肌骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种糖基化磷蛋白,其作用主要是具有细胞黏附功能。整合素(integrin)包括α亚基与β亚基,是重要的一类黏附分子,其作用主要为介导细胞以及细胞外基质与细胞间的信号转导以及粘附。而整合素αvβ3主要是经识别并结合OPN,然后通过跨膜信号转导至胞内,而且它在心血管病理以及生理机制中也具有重要作用［1-2］。本研究旨在通过肺动脉高压大鼠心肌骨桥蛋白及其整合素β3受体基因表达变化与右心室重塑的关系,探讨肺动脉高压形成的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选自于昆明医学院实验动物中心的二级雄性(SD)大鼠60只(合格证号:410117号),月龄9个月,平均体质量为(260.15±31.23)g。

1.2 主要试剂 Trizol reagent RNA提取试剂盒、随机引物与Taq DNA polymerase购自 Promega公司,M-MLV和 RNase inhibitor购自美国 Invitrogen公司。野百合碱(Monocrotaline,MCT),购自美国Sigma Chemical Co.公司。引物合成委托北京赛百盛生物有限公司完成。

1.3 动物模型的建立 60只健康的雄性SD大鼠,按照随机数字表法分为5组,每组各12只,为4个肺动脉高压实验组(PAH组)与1个对照组。大鼠饲养适应5～7 d后,以60mg/kg体重给实验组大鼠皮下注射野百合碱,分别在注射后第1,2,3,4周的4个时间点取材,命名为PAH1、PAH2、PAH3和PAH4组。对照组采用皮下注射等量生理盐水。测量各组血流动力学指标后,将动物放血处死,取心肺标本,从右心室顺着室间隔剪下,同时将心肺组织置于液氦内冷冻待测。分别称取左心室加室间隔(LV+S)以及右心室(RV)重量,同时对右心室肥厚指数［Rv/(LV+S)］进行计算。

1.4 骨桥蛋白以及整合素β3 mRNA表达测定 总RNA按照Trizol一步法由右心室中提取。20μL反应体系,逆转录合成cDNA。 其模板为 β-actin mRNA、osteopontin mRNA、integrinβ3 mRNA,设计引物如下。

表1 大鼠OPN,integrinβ3及β-actin引物设计Tab.1 Rat OPN,integrinβ3 andβ-actin primer design

1.5 免疫组织化法测定OPN和整合素β3蛋白表达 取3～5mm由心肺组织蜡块制成的切片,按以下步骤操作:①常规酒精梯度脱水与二甲苯脱蜡;②取新鲜H2O230mL封闭内源性酶15min;然后进行冲洗,冲洗完后给予PBS浸泡5min;③将切片置于pH=8.0的EDTA组织抗原修复液中,再利用微波加热修复10～12min,20min后加一抗于4℃条件下放置过夜;④第2天复温后,加入二抗,室温条件下孵育30min左右;⑤将辣根酶标记链霉素卵白素工作液加至玻片上,然后在室温条件下孵育25～30min;⑥在室温条件下加入DAB试剂显色5～20min,显色后用自来水充分洗涤;⑦再经苏木精复染后进行脱水,二甲苯透明,封片采用中性树脂。设置2组,分别为阳性对照组与阴性对照组,其中本组所用的阳性对照切片由本院病理科提供,阴性对照组为PBS代替一抗作。细胞胞质有呈棕黄色的颗粒表示OPN和整合素β3阳性表达,采用IBAS 2.5全自动图像分析系统,400倍光镜下分别取每张切片的5个不同视野测定测试区域的灰度值,求得平均值。

1.6 Western blot检测OPN和整合素β3蛋白表达的水平

取各组心肌组织0.1 g加三去污裂解液200μL于冰上裂解30 min后提取总蛋白,常规进行蛋白电泳和膜转入。在进行一次抗体反应(1∶200,4℃,12 h)后进行二次抗体反应(1∶1,1 h),再与过氧化酶标记的链球菌抗生物素蛋白(1∶1)反应1 h。用增强的蛋白反应系统探测免疫反应带。反应带显色于柯达胶片后,将胶片置于ES2000扫描仪中扫描并将图像经Power Mac Photoshop6.0软件转送至NIH-Image 1.62软件中。使用NIHImage gelmacro工具对反应带的面积和密度进行测定,并计算心肌组织OPN和整合素β3蛋白表达水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0进行数据分析,正态计量资料用“±s”表示,组间两两比较采用t检验;相关性分析采用Pearson相关系数的计算并检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌组织OPNy与整合素β3mRNA表达水平比较 与对照组大鼠相比,肺动脉高压各组右心室心肌OPN与整合素β3表达显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05,见图1);且其表达水平随着肺动脉高压时间延长呈现不断上升趋势。

图1 各组心肌组织OPNy与整合素β3 mRNA水平比较*P＜0.05,与对照组比较Fig.1 Comparison ofmyocardial tissue OPNy and integrinβ3 mRNA levels in each group*P＜0.05,compared with control group

2.2 相关性分析 相关性分析显示与PAH4组右心室肥厚指数与右心室心肌0PN mRNA表达水平呈明显正相关性(r=0.828,P＜0.01),同时与右心室心肌整合素β3 mRNA也呈明显正相关(r=0.822,P＜0.01)。

2.3 免疫组化检测各组右心室心肌组织OPN和整合素β3免疫组化蛋白表达 OPN和整合素β3主要表达于心肌细胞胞浆中,在光镜下呈棕黄色染色。对照组左、右心室心肌组织OPN和整合素β3表达水平均很低。肺高压各组左、右心室心肌OPN和整合素β3表达水平明显增高(见图2、表2),并随着肺动脉高压产生的时间延长而增高。与对照组比较差异均有统计学差异(P＜0.01)。

图2 对照组和PAH4组右心室心肌OPN和整合素β3免疫组化结果Fig.2 Immunohistochemical results of right ventricular OPN and integrinβ3 expression in control group and PAH 4 group

表2 各组右心室心肌组织中OPN和整合素β3表达比较Tab.2 Comparison of OPN and integrinβ3 expression in right ventricular myocardial tissue in each group

2.3 Western blot检测各组OPN和整合素β3蛋白表达在实验第4周,PAH4组大鼠右心室心肌组织OPN和整合素β3蛋白表达水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01,见图3)。

图3 OPN和整合素β3蛋白免疫结果*P＜0.05,与对照组比较Fig.3 OPN and integrinβ3 protein immunoblotmap*P＜0.05,compared with control group

3 讨论

3.1 OPN在心肌重建中的作用 OPN是细胞外基质重要的功能性蛋白质,有报道表明,OPN是血管平滑肌细胞由收缩型向合成表型转化的标记［3］。OPN在心血管系统主要是来源于巨噬细胞、VSMC以及EC。而对于OPN与VSMC、EC两者之间的作用常见于依赖RGD以及Ca2+抗αVβ3抗体,同时可使这些细胞部分阻滞向OPN迁移［4］。故VSMC、EC两组能够表达OPN,同时具有相互作用。研究结果显示［5］,缺乏OPN的大鼠VSMC中有2种细胞功能改变:VSMC凋亡增加以及VSMC黏附胶原功能缺陷,故而显示OPN能够抑制VSMC的凋亡［6］。

OPN能与细胞表面整合素受体结合,其中所结合的整合素中含有α,β2种亚基,并且其组成分为包括胞内、细胞外功能域以及跨膜段。OPN早期主要是经焦点粘附激酶(FAK)酪氨酸磷酸化而使其激活,由此可知细胞迁移过程中FAK激活具有重要作用。突变分析结果发现,在介导细胞迁移过程中FAK产Tyr397是其关键部位。FAK激活后的信号转导包括2个方向,一是经Grb2/sos进入Ras途径;二是FAK/Src结合,进入Ras途径,最终激活丝裂原激活蛋白酶(MAPK)［7］。而激活的 MAPK能够经对调节基因表达,从而致使信号蛋白(主要包括桩蛋白、P130csa)与其它细胞骨架蛋白等磷酸化,故而起调节细胞骨架的细胞迁移以及动态组装功能。细胞内信号转导是一个网络结构,而非单一通路。

3.2 整合素和肺动脉高压以及心肌重建的关系 粘附是细胞生长与损伤修复一个重要环节。生长因子(主要包括血管紧张素II)则可促进鼠心肌间质纤维细胞ανβ3和β5的mRNA水平的提高。ανβ3能够与多种含RGD基序的配基(主要包括Fn、Fg、Col)以及血小板反应素等结合,而 βl和 ανβ5则主要分别与Col和Vn结合［11-14］。故而ECM蛋白与生长因子(护腰包括血管紧张素II)共同作用于心肌间质纤维细胞后激活细胞信号转导通路,进而使细胞生长得以促进,由此可知ECM在心肌重建过程中具有重要作用［12-13］。

本研究显示:与对照组大鼠右心室心肌OPN与整合素β3表达相比,肺动脉高压各组表达较对照组显著高,且差异具有统计学意义(P＜0.05);肺高压组左、右心室心肌OPN和整合素β3受体蛋白表达水平增高,并随着肺动脉高压产生的时间延长而增高。与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05);相关性分析显示与右心室肥厚指数与右心室心肌0PN mRNA表达水平呈明显正相关性(r=0.828,P＜0.01),同时右心室肥厚指数与右心室心肌整合素β3 mRNA也呈明显正相关(r=0.822,P＜0.01)。故肺动脉高压时右室压力负荷的上升致使右心室肥大与心肌细胞高表达OPN及其整合素β3可能有关。然而,OPN如何促进细胞增殖以及下游信号转导途径是什么尚等进一步研究。而适度阻断OPN的合成,可能为临床上治疗各类心血管疾病所致的血管及心肌重塑提供新的策略。

［1］ 唐仁泓，龙剑锋，陈百华.整合素αvβ3、组织因子及血管内皮细胞生长因子在实验性脉络膜新生血管中的表达［J］.中南大学学报（医学版)，2009，34（8):762-767.

［2］ Azuma J，Asagami T，Dalman R，et al.Creation ofmurine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase［J］.J Vis Exp，2009，13（29):1280.

［3］ Trueblood NA，Xie Z， Communal C，et al.Exaggerated left ventricular dilation and reduced collagen deposition after myocardial infarction in mice lacking osteopontin［J］.Circ Res， 2001， 88（10):1080-1087.

［4］ Mi T，Nie B，Zhang C，et al.The elevated expression of osteopontin and NF-kappaB in human aortic aneurysms and its implication［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011，31（ 5):602-607.

［5］ Schweitzer M，Mitmaker B，Obrand D，et al.Atorvastatin modulates matrixmetalloproteinase expression，activity，and signaling in abdominal aortic aneurysms［J］.Vasc Endovascular Surg，2010，44（ 2):116-122.

［6］ 林全，王良兴，黄晓颖，等.葛根素对缺氧性大鼠肺组织骨桥蛋白及其整合素β3受体基因表达的影响［J］.中国药理学通报，2009，25（7):887-890.

［7］ Gravallese EM.Osteopontin:a bridge between bone and immune system［J］.JClin Invest，2003，112（2):147-149.

［8］ 高培国，强辉，凌鸣.葛根素对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用［J］.西安交通大学学报，2012，33（2):245-260.

［9］ Magno AL，Ward BK， Ratajczak T.The calcium-sensing receptor:a molecular perspective［J］.Endocr Rev，2011，32（1):3-30.

［10］ Desgrosellier JS， Cheresh DA.Integrins in cancer:biological implications and therapeutic opportunities［J］.Nat Rev Cancer，2010，10（1):9-22.

［11］ Pinon P， Wehrle-Haller B.Integrins:versatile receptors controlling melanocyte adhesion，migration and proliferation［J］.Pigment Cell Melanoma Res，2011，24（ 2):282-294.

［12］景丽丽，周建中，张良珂.RGD靶向溶栓药物的研究进展［J］.心血管病学进展，2010，31（2):209-212.

［13］ Comisar WA，Mooney DJ，Linderman JJ.Integrin organiztion:linking adhesion ligand nanopatterns with altered cell responses［J］.J Ther Biol，2011，274（1):120-130.

(编校:吴茜)

Changes of expressions of osteopontin and integrinβ3 mRNA in right ventricle of pulmonary hypertensive rats

PANG Qi-ming1,LIKun2

(1.Department of Pediatrics,The Central Hospital of Zibo,Shandong 255000,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,The Affiliated Hospital of Shandong Province Academy of Medical Sciences,Shandong 250031,China)

Objective To observe osteopontin and integrin β3 receptor gene expression in cardiac pulmonary hypertension rats and their relationship with right ventricular remodeling.Methods 60 SD were random ly divided into 5 groups,control group and 4 experimental pulmonary hypertension(PAH)goups.Pulmonary hypertension ratsmodelwere constructed by subcutaneous injection ofmonocrotaline,and samples were obtained with 1,2,3,4 weeks after injected,and named as PAH1,PAH2,PAH3 and PAH4 experimental groups.Mean pulmonary arterial pressure(mPAP)and right ventricular hypertrophy index were determined in each groups.The right ventricle myocardial osteopontin(OPN)and integrinβ3 receptormRNA expression levels were detected by immunohistochemistry,western blot and RT-PCR method at different time points in rats in each group.Results Compared with controlgroup,integrinβ3 and OPN expression in each PAH group increased significantly,the differencewere statistically significant(P＜0.05);and their expression were increased with the extension time to produce pulmonary hypertension.Correlation analysis results showed that right ventricular hypertrophy index and right ventricular OPN mRNA expression were positivily correlated(r=0.828,P＜0.01),right ventricular hypertrophy index and integrinβ3 mRNA were also positivily correlated(r=0.822,P＜0.01).Conclusion In the process of pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy formation of rats,OPN and integrinβ3 receptor gene expression increased in the right ventricle myocardial,their expression probably plays an important role in the right ventriclemyocardial remodeling.

osteopontin;integrin β3;ratmodel of pulmonary high pressure

R285.5

A

1005-1678（2014)06-0029-04

山东省自然科学基金(ZR2009CL027)；济南市科技局科技明星计划(20100118)；山东省医学科学院医学基金(201023)

庞启明，女，硕士，主治医师，研究方向：小儿神经与遗传，E-mail： 69704936@qq.com。