D-对羟基苯海因细菌的发酵工艺优化研究

贺莹+王晓冬+乔元彪

摘 要：通过筛菌得到一株野生菌 LLV-6，在诱导剂诱导后利用DL-对羟基苯海因（DL-HPH）为底物经D-海因酶（HYD）和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶（CAB）两酶水解而获得D-对羟基苯甘氨酸。用LB培养基（含磷酸盐缓冲溶液，pH=7.2）接菌量为0.5%（对数期的菌种），在37℃、200r、pH7.2条件下培养菌种。在培养12h后加入2%的诱导剂并以500μLDMSO作为促溶剂，33h后收集细胞。通过对细胞酶活力的测定，此时酶活力达到最大值，酶活力为0.57U/L，比优化前提高了2.6倍。

关键词：D-对羟基苯甘氨酸；时间诱导；浓度诱导；酶活力

中图分类号Q55 文献标识码A 文章编号1007-7731（2014）14-24-03

The Optimization of Fermentation Process of DL-Hydroxyphenyl Hydantoin Bacterial

He Ying et al.

（Department of Life Science，Lvliang College，Lvliang 033000，China）

Abstract:Through the sieve bacteria get one natural bacteria LLV-6，In inducers induced effect after using the DL-Hydroxyphenyl Hydantoin（DL-HPH） as the substrate by D-hydantoinase（HYD）and N-carbamoylase（CAB）two enzyme hydrolysis of D-p-Hydroxyphenylglycine（D-HPG）. Using LB culture medium（containing phosphate buffer solution，pH=7.2）the inoculation quantity was 0.5%（Logarithmic phase），the bacteria cultured at 37℃，200r，pH7.2 conditions. In 12 hours after adding 2% inducers and with DMSO as solvent，33 hours after collection of the cell. By measuring the enzyme activity of the cells，the enzyme activity reached a maximum value at this time，Enzyme activity was 0.57U/L，more than 2.6 times before optimization.

Key words：D-p-hydroxyphenylglycine；Induction time；Concentration induced；Enzyme activity

D-对羟基苯甘氨酸（D-p-Hydroxyphenylglycine，D-HPG）是主要用作合成青霉素和半合成头孢菌素类药物的侧链化合物。用其生产的主要药品有羟氨苄青霉素（阿莫西林）、羟氨苄青霉素克拉维酸盐、羟氨苄头孢、羟氨苄唑头孢、头孢哌酮、头孢曲嗪等，这些药物用途广泛，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、弓形菌、螺旋体等均有杀灭作用；还应用于感光领域和用作铁、磷、硅等的分析试剂，需求量呈逐年递增趋势[1-2]。目前对羟基苯甘氨酸的生产工艺有化学法和生物法2种。生物法是先以化学合成的DL-对羟基苯海因作为生物酶作用的底物，利用D-海因酶（HYD）和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶（CAB）这2个酶连续反应作用于底物制备D-对羟基苯甘氨酸。首先，HYD催化海因或其衍生物5，单替代海因生成氨甲酞基衍生物，然后CAB接着作用于该中间产物使其水解脱去氨甲酞基从而生成D-对羟基苯甘氨酸[3-5]。本实验以一株天然菌LLV-6，在诱导剂诱导后利用DL-对羟基苯海因（DL-HPH）为底物经水解后可获得D-对羟基苯甘氨酸。笔者在测得LLV-6的生长曲线后，通过不同时间点加入相同诱导剂对酶活力影响的实验和相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力影响的实验，确定其诱导时间和诱导剂的浓度，以期为该法工业化生产D-对羟基苯甘氨酸提供技术参数[6]。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂 出发菌株：菌种LLV-6，由本实验室保藏。LB液体培养基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母浸膏，1.0%NaCl（pH7.2）。LB固体培养基为在上述LB液体培养基中添加1.5%琼脂粉。试验试剂：二甲基亚砜（DMSO）、磷酸二氢钾、氢氧化钠、乙腈、磷酸、对羟基苯海因、对羟基苯甘氨酸、琼脂等试剂为分析纯，实验用水为蒸馏水经超纯水装置再处理后的超纯水。

1.2 仪器与设备 振荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、UV-2100双光束紫外可见分光光度计（上海棱光有限公司）、洁净工作台（上海博讯有限公司）、高效液相色谱仪（北京北分瑞利分析仪器有限责任公司）、立式压力蒸汽灭菌器筒（上海博讯有限公司）、台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、台式低速自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、旋涡混合器（Daihan scientific）、反渗透纯水系统、OLYMPUS BX41正置系统金相显微镜、电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、智能型冷藏箱（宁波市科技园区新江南仪器有限公司）、J1000型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）、电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）、电子调温电热套（重庆市吉祥教学设备有限公司）、数显鼓风干燥箱（上海博讯有限公司）、KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、LGJ-10冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）、恒温水浴锅（宁波市新芝科器研究所）。

1.3 方法

1.3.1 野生菌LLV-6生长曲线的测定 将4℃保存的野生菌LLV-6于固体LB平板划线，37℃培养过夜。次日挑取单菌落接种于100mL LB培养液（含磷酸盐缓冲液）中，37℃振荡培养至OD600为0.6～0.8时作为种子液。以0.5%接种量分别接种三角瓶培养基中，每2h测定一次，一次测3瓶，测其平均值，直到OD值下降，然后绘制生长曲线。

1.3.2 野生菌LLV-6的培养 挑取单菌落接种于100mL LB培养液（含磷酸盐缓冲液）中，37℃振荡培养OD600为0.6～0.8时，再以0.5%接种量接种到三角瓶中，37℃扩大培养至12h，加入2%的对羟基苯海因并加入促溶剂DMSO，再在37℃继续培养16～18h，即可离心收集菌体细胞后进行冷冻干燥。

1.3.3 对羟基苯甘氨酸和对羟基苯海因标准曲线的测定 对羟基苯甘氨酸在水中微溶，在10mL水中加入对羟基苯甘氨酸0.01g使其浓度为0.1%。通过加水稀释使对羟基苯甘氨酸浓度分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%，并且编号1～9，浓度为0.1%的编号为10号。通过高效液相色谱仪，分别测定其峰电平值。最后绘制其标准曲线，标准曲线见图2。用同样的方法测定对羟基苯海因的标准曲线，标准曲线见图3。

1.3.4 不同时间点加入相同诱导剂对酶活力的影响 通过绘制的生长曲线，在不同时间点加入相同的诱导剂分别测定其酶的活力。以0.5%接种量，加诱导剂的时间点分别为4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h。培养28～30h后离心收集菌体细胞后进行冷冻干燥，收集菌体备用测定酶活。

1.3.5 在相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力的影响 确定了加入诱导剂时间点后，在相同的时间点加入不同浓度诱导剂分别测定其酶的活力。在确定的时间点培养基中加入相同0.5%的促溶剂DMSO，但对羟基苯海因的量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，并全部以0.5%接种量。培养28～30h后离心收集菌体细胞后进行冷冻干燥，收集菌体备用测定酶活。

1.3.6 水解酶活的测定 取一定量的细胞和以对羟基苯海因为底物在45℃、200r/min、pH7～8的无氧体系的条件下进行水解实验。一段时间后取1mL的菌液在10 000r/min、10min离心后取上清液，通过高效液相色谱仪和对羟基苯甘氨酸标准曲线测定酶活[7-8]。酶活力单位定义：1min内生成1mg D-对羟基苯甘氨酸所需酶量为1个酶活单位（U）。

1.3.7 验证试验 用LB培养基（含磷酸盐缓冲溶液，pH=7.2）接菌量为0.5%（对数期的菌种），在37℃、200r、pH7.2条件下培养菌种。在培养12h后加入2%的诱导剂，并以500μLDMSO作为促溶剂，33h后收集细胞，测定细胞酶活力的，平均测3次。

2 结果与分析

2.1 野生菌LLV-6生长曲线的测定 由图1可知，该菌的对数期为3～16h，稳定期为16～36h，之后衰退。

图1 LLV-6生长曲线

2.2 对羟基苯甘氨酸和对羟基苯海因的标准曲线的测定 详见图2、图3。

图2 对羟基苯甘氨酸标准曲线

图3 对羟基苯海因标准曲线

2.3 不同时间点加入相同诱导剂对酶活力的影响 由图4可知，以接菌量为0.5%接入菌后第12h左右加入诱导剂（含促溶剂）效果最好，酶活最高，而其他时间点加入酶活则没有在第12h左右高。原因可能是在第12h为该菌的生长对数期的中后期，此时已经有大量细胞并且生长旺盛，在诱导剂的作用下产生诱导酶。

图4 不同时间点加入诱导剂对酶活力的影响

2.4 相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力的影响 由图5可知，以接菌量为0.5%接入菌后第12h左右加入0.2%的诱导剂（含促溶剂）效果最好，酶活最高。

图5 相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力的影响

2.5 验证试验 在本试验设定的工艺下，平均酶活力达到了0.57U/L，比优化前提高了2.6倍。

参考文献

[1]ShigeruM，H iromi S，ShindouM，et al.Synthesis and her bicidalactivity of deoxy derivatives of（+）hydantocidin[J].Agric BiolChem，1991，55：1105-1109.

[2]Kenzo Y，Shigeru N.Optimal conditions for the enzy-matic production of D-amino acids from the correspond-ing 5 substituted hydantoin[J].Agric Biol Chem，1987（54）:715-719.

[3]董妍玲，谭新国，潘学武.海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展[J].Amino Acids& Biotic Resources，2009，31（3）：47-52

[4]ChaoYP，Chiang CJ，ChenPT.Optimum ratio of D-carbamoylase to D-hydantoinase for maxim izing D-p-hydroxyphenylglycine productivity[J]. BiotechnologyLetters，2000，22：99-103.

[5]吕彬峰，钱俊青，应雪肖.海因酶产生菌的反应条件研究[J].浙江工业大学学报，2007，35：505-508.

[6]WANG Xiaoping，XING Shuli，Coomassie brilliant blue method was developed for the determination of protein content in research[J].Tianjin Chemical Industry，2009，23（3）.

[7]宋慧敏，屠春燕，欧阳平凯.高效液相色谱法测定D-对羟基苯甘氨酸[J].南京工业大学学报（自然科学版），2002，24（4）：97-99.

[8] Niu LX，Zhang XY，Shi YW，et al. Subunit dissociationand stability alteration of D-hydantoinase deleted at theterminal amino acid residue[J].Biotechnol Lett，2007，29（2）：303-308.

[9]江南，吴开力，黄强，等.一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法[J].生物化学与生物物理进展，2000，27（5）：560-563.

（责编：张宏民）

1.3.4 不同时间点加入相同诱导剂对酶活力的影响 通过绘制的生长曲线，在不同时间点加入相同的诱导剂分别测定其酶的活力。以0.5%接种量，加诱导剂的时间点分别为4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h。培养28～30h后离心收集菌体细胞后进行冷冻干燥，收集菌体备用测定酶活。

1.3.5 在相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力的影响 确定了加入诱导剂时间点后，在相同的时间点加入不同浓度诱导剂分别测定其酶的活力。在确定的时间点培养基中加入相同0.5%的促溶剂DMSO，但对羟基苯海因的量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，并全部以0.5%接种量。培养28～30h后离心收集菌体细胞后进行冷冻干燥，收集菌体备用测定酶活。

1.3.6 水解酶活的测定 取一定量的细胞和以对羟基苯海因为底物在45℃、200r/min、pH7～8的无氧体系的条件下进行水解实验。一段时间后取1mL的菌液在10 000r/min、10min离心后取上清液，通过高效液相色谱仪和对羟基苯甘氨酸标准曲线测定酶活[7-8]。酶活力单位定义：1min内生成1mg D-对羟基苯甘氨酸所需酶量为1个酶活单位（U）。

1.3.7 验证试验 用LB培养基（含磷酸盐缓冲溶液，pH=7.2）接菌量为0.5%（对数期的菌种），在37℃、200r、pH7.2条件下培养菌种。在培养12h后加入2%的诱导剂，并以500μLDMSO作为促溶剂，33h后收集细胞，测定细胞酶活力的，平均测3次。

2 结果与分析

2.1 野生菌LLV-6生长曲线的测定 由图1可知，该菌的对数期为3～16h，稳定期为16～36h，之后衰退。

图1 LLV-6生长曲线

2.2 对羟基苯甘氨酸和对羟基苯海因的标准曲线的测定 详见图2、图3。

图2 对羟基苯甘氨酸标准曲线

图3 对羟基苯海因标准曲线

2.3 不同时间点加入相同诱导剂对酶活力的影响 由图4可知，以接菌量为0.5%接入菌后第12h左右加入诱导剂（含促溶剂）效果最好，酶活最高，而其他时间点加入酶活则没有在第12h左右高。原因可能是在第12h为该菌的生长对数期的中后期，此时已经有大量细胞并且生长旺盛，在诱导剂的作用下产生诱导酶。

图4 不同时间点加入诱导剂对酶活力的影响

2.4 相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力的影响 由图5可知，以接菌量为0.5%接入菌后第12h左右加入0.2%的诱导剂（含促溶剂）效果最好，酶活最高。

图5 相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力的影响

2.5 验证试验 在本试验设定的工艺下，平均酶活力达到了0.57U/L，比优化前提高了2.6倍。

参考文献

[1]ShigeruM，H iromi S，ShindouM，et al.Synthesis and her bicidalactivity of deoxy derivatives of（+）hydantocidin[J].Agric BiolChem，1991，55：1105-1109.

[2]Kenzo Y，Shigeru N.Optimal conditions for the enzy-matic production of D-amino acids from the correspond-ing 5 substituted hydantoin[J].Agric Biol Chem，1987（54）:715-719.

[3]董妍玲，谭新国，潘学武.海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展[J].Amino Acids& Biotic Resources，2009，31（3）：47-52

[4]ChaoYP，Chiang CJ，ChenPT.Optimum ratio of D-carbamoylase to D-hydantoinase for maxim izing D-p-hydroxyphenylglycine productivity[J]. BiotechnologyLetters，2000，22：99-103.

[5]吕彬峰，钱俊青，应雪肖.海因酶产生菌的反应条件研究[J].浙江工业大学学报，2007，35：505-508.

[6]WANG Xiaoping，XING Shuli，Coomassie brilliant blue method was developed for the determination of protein content in research[J].Tianjin Chemical Industry，2009，23（3）.

[7]宋慧敏，屠春燕，欧阳平凯.高效液相色谱法测定D-对羟基苯甘氨酸[J].南京工业大学学报（自然科学版），2002，24（4）：97-99.

[8] Niu LX，Zhang XY，Shi YW，et al. Subunit dissociationand stability alteration of D-hydantoinase deleted at theterminal amino acid residue[J].Biotechnol Lett，2007，29（2）：303-308.

[9]江南，吴开力，黄强，等.一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法[J].生物化学与生物物理进展，2000，27（5）：560-563.

（责编：张宏民）

1.3.4 不同时间点加入相同诱导剂对酶活力的影响 通过绘制的生长曲线，在不同时间点加入相同的诱导剂分别测定其酶的活力。以0.5%接种量，加诱导剂的时间点分别为4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h。培养28～30h后离心收集菌体细胞后进行冷冻干燥，收集菌体备用测定酶活。

1.3.5 在相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力的影响 确定了加入诱导剂时间点后，在相同的时间点加入不同浓度诱导剂分别测定其酶的活力。在确定的时间点培养基中加入相同0.5%的促溶剂DMSO，但对羟基苯海因的量分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，并全部以0.5%接种量。培养28～30h后离心收集菌体细胞后进行冷冻干燥，收集菌体备用测定酶活。

1.3.6 水解酶活的测定 取一定量的细胞和以对羟基苯海因为底物在45℃、200r/min、pH7～8的无氧体系的条件下进行水解实验。一段时间后取1mL的菌液在10 000r/min、10min离心后取上清液，通过高效液相色谱仪和对羟基苯甘氨酸标准曲线测定酶活[7-8]。酶活力单位定义：1min内生成1mg D-对羟基苯甘氨酸所需酶量为1个酶活单位（U）。

1.3.7 验证试验 用LB培养基（含磷酸盐缓冲溶液，pH=7.2）接菌量为0.5%（对数期的菌种），在37℃、200r、pH7.2条件下培养菌种。在培养12h后加入2%的诱导剂，并以500μLDMSO作为促溶剂，33h后收集细胞，测定细胞酶活力的，平均测3次。

2 结果与分析

2.1 野生菌LLV-6生长曲线的测定 由图1可知，该菌的对数期为3～16h，稳定期为16～36h，之后衰退。

图1 LLV-6生长曲线

2.2 对羟基苯甘氨酸和对羟基苯海因的标准曲线的测定 详见图2、图3。

图2 对羟基苯甘氨酸标准曲线

图3 对羟基苯海因标准曲线

2.3 不同时间点加入相同诱导剂对酶活力的影响 由图4可知，以接菌量为0.5%接入菌后第12h左右加入诱导剂（含促溶剂）效果最好，酶活最高，而其他时间点加入酶活则没有在第12h左右高。原因可能是在第12h为该菌的生长对数期的中后期，此时已经有大量细胞并且生长旺盛，在诱导剂的作用下产生诱导酶。

图4 不同时间点加入诱导剂对酶活力的影响

2.4 相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力的影响 由图5可知，以接菌量为0.5%接入菌后第12h左右加入0.2%的诱导剂（含促溶剂）效果最好，酶活最高。

图5 相同的时间点加入不同浓度诱导剂对酶活力的影响

2.5 验证试验 在本试验设定的工艺下，平均酶活力达到了0.57U/L，比优化前提高了2.6倍。

参考文献

[1]ShigeruM，H iromi S，ShindouM，et al.Synthesis and her bicidalactivity of deoxy derivatives of（+）hydantocidin[J].Agric BiolChem，1991，55：1105-1109.

[2]Kenzo Y，Shigeru N.Optimal conditions for the enzy-matic production of D-amino acids from the correspond-ing 5 substituted hydantoin[J].Agric Biol Chem，1987（54）:715-719.

[3]董妍玲，谭新国，潘学武.海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展[J].Amino Acids& Biotic Resources，2009，31（3）：47-52

[4]ChaoYP，Chiang CJ，ChenPT.Optimum ratio of D-carbamoylase to D-hydantoinase for maxim izing D-p-hydroxyphenylglycine productivity[J]. BiotechnologyLetters，2000，22：99-103.

[5]吕彬峰，钱俊青，应雪肖.海因酶产生菌的反应条件研究[J].浙江工业大学学报，2007，35：505-508.

[6]WANG Xiaoping，XING Shuli，Coomassie brilliant blue method was developed for the determination of protein content in research[J].Tianjin Chemical Industry，2009，23（3）.

[7]宋慧敏，屠春燕，欧阳平凯.高效液相色谱法测定D-对羟基苯甘氨酸[J].南京工业大学学报（自然科学版），2002，24（4）：97-99.

[8] Niu LX，Zhang XY，Shi YW，et al. Subunit dissociationand stability alteration of D-hydantoinase deleted at theterminal amino acid residue[J].Biotechnol Lett，2007，29（2）：303-308.

[9]江南，吴开力，黄强，等.一种简便的考马斯亮蓝G250蛋白质染色方法[J].生物化学与生物物理进展，2000，27（5）：560-563.

（责编：张宏民）