载micro RNA-34a脂质体靶向治疗肺癌干细胞靶的研究

赵欣

（新乡医学院第一附属医院 呼吸科，河南 新乡453000）

载micro RNA-34a脂质体靶向治疗肺癌干细胞靶的研究

赵欣

（新乡医学院第一附属医院 呼吸科，河南 新乡453000）

目的制备载microRNA-34 a脂质体（miLPs-34 a），研究其肺癌干细胞靶向性以及对肺癌干细胞的生长抑制能力。方法采用薄膜分散法制备载microRNA-34 a脂质体，考察脂质体的粒径，电位以及包封率;考察载microRNA-34 a脂质体的血清稳定性。通过细胞摄取实验考察肺癌干细胞对miLPs-34 a的摄取效率。MTT实验考察microRNA-34 a对肺癌干细胞的细胞毒性;构建肺癌干细胞肿瘤球模型，考察脂质体对肿瘤球的生长抑制能力。构建肺癌裸鼠异位模型，考察脂质体对肿瘤生长抑制效果。结果miLPs-34 a的粒径在136.55±11.4 nm，电位为21.45±4.55 mV，microRNA-34 a的包封率为94.6%。miLPs-34 a在24 h内，50%的血清中具有良好的血清稳定性。细胞摄取实验结果显示，A 549肺癌干细胞对miLPs-34 a的摄取效率是microRNA-34 a的3.1倍(P＜0.01);MTT实验表明miLPs-34 a对肺癌干细胞的毒性显著强于microRNA-34 a(P＜0.01);肿瘤球抑制实验结果表明miLPs-34 a对肿瘤球的生长抑制能力显著强于microRNA-34 a，差异具有统计学意义（P＜0.01），miLPs-34 a具有良好的抗肺癌作用。荷瘤裸鼠肿瘤生长抑制实验结果表明miLPs-34 a对裸鼠肿瘤生长的抑制能力显著强于microRNA-34 a，二者差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论载microRNA-34 a脂质体具有良好的肺癌干细胞靶向性和抗肺癌干细胞生长作用，是一种潜在高效的肺癌干细胞靶向给药系统。

肿瘤干细胞;microRNA-34 a;脂质体;肺癌

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 Sizer Nano ZS 90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪（英国Malvern instruments Ltd）；Bio-Tek ELX 800光吸收酶标仪（美国宝特仪器公司）；大豆磷脂（SPC，上海太伟药业有限公司）；DOTAP（美国Avanti polar lipids）；DSPE-PEG 2000（美国Avanti polar lipids）；异硫氰黄荧光素标记的磷脂（FITC-PE，美国sigma）；microRNA-34 a（上海吉玛生物技术有限公司）；Cy3标记的microRNA-34 a（美国GIBCO公司）；DSPE-PEG 2000-MAL (美国sigma)；DMEM高糖培养基（美国GIBCO公司）；其余试剂为分析纯。人源肺癌细胞（A549，ATCC)；昆明小鼠与裸鼠（许可证号：20135486154；新乡医学院动物实验中心）。

1.2 方法

1.2.1 载microRNA-34 a脂质体的制备及表征 精密称取大豆磷脂4 mg，胆固醇2 mg，DSPE-PEG 20001 mg，DOTAP 2 mg，将以上材料和药物溶于氯仿中，在茄形瓶中减压蒸馏成膜，除去有机溶剂，置于真空干燥器中过夜，使其充分干燥，加入1 ml PBS水化，探头超声（80 W，10 s，10 s，5次）得到空白脂质体。取一定量上述空白脂质体溶液稀释至50µL，逐滴加入等体积的RNA（miRNA）溶液，在室温下轻轻振摇孵育30 min，即得miLPs-34 a溶液。采用相同方法制备miLPs-34 a（Cy3）。

取适量制备得到的脂质体样品0.1 mL稀释到1 mL，用激光粒度仪测定其粒径和电位。采用超滤离心法测定miRNA的包封率。取100µL所制备的miLPs-34 a（Cy3），用超滤管（300 kD），转速3500离心30 min。收集超滤管收集管中的澄清液体，并稀释至合适浓度，用酶标仪在Ex=555 nm，Em=570 nm处测定其荧光强度。按照EE%=W包/W投×100%计算包封率。

1.2.2 载microRNA-34 a脂质体的血清稳定性考察 取脂质体样品500µL，每个样品3份。分别与等体积的磷酸盐缓冲液、含有50%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液混合，于37℃下孵育1、4、8、12、24 h，分别测定其在750 nm的透光率[7-8]。以样品在磷酸盐缓冲液中的透光率值为空白，以样品在含有50% FBS的磷酸盐缓冲液中的透光率与其在磷酸盐缓冲液中的透光率的比值来评价纳米粒在血清中的稳定性。

1.2.3 肺癌干细胞对miLPs-34 a的摄取考察 将A549肺癌干细胞按照1×105细胞/孔接种于24孔板中，培养24 h后，在孔板中加入Cy3标记的microRNA-34 a和miLPs-34 a（Cy3），每组设3组重复，每个孔加入100 uL，每一个细胞孔给药量相当于0.7µg miRNA。于CO2培养箱中分别孵育2 h和4 h，弃去培养基，加入适量PBS清洗3次，加入1 mL 1% Triton-100裂解细胞，4℃避光裂解30 min以上，待裂解完全后，取各组样品各200 uL在Ex=555 nm，Em=570 nm用荧光分光光度计测定的荧光强度。

1.2.4 MTT方法考察miLPs-34 a对肺癌干细胞的增殖抑制作用 培养A 549肿瘤干细胞接种于96孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入无菌过滤后的空白脂质体、microRNA-34 a和miLPs-34 a。每组设6组重复，每孔加入相当于miRNA的量为150 nM的脂质体（或空白脂质体）。将孔板移入37℃CO2孵箱中培养24 h和48 h后取出，每孔加入20µL 5 mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中继续孵育4 h，将孔板中液体倒出，每孔加入200µl DMSO，37℃避光振摇15 min，用酶标仪在490 nm处测定各孔的光密度值。

1.2.5 肺癌肿瘤球的构建及miLPs-34 a对肿瘤球的抑制作用 取对数生长期的A549肿瘤干细胞用0.125%胰酶消化后，用含血清的培养基中和胰酶，并将细胞吹打下来后离心，弃去上清液用培养基重悬细胞后接种于用低熔点琼脂糖预处理的96孔板中，将96孔板移入37℃CO2孵箱中培养。7天后成长为肿瘤球，肿瘤球体积约为0.5 mm3，以带标尺的目镜观察肿瘤球的半径，按球体积计算公式V=（4/3）πR3计算肿瘤球的体积。为了考察miLPs-34 a对肿瘤球生长的抑制效果，肿瘤球生长7天后，加入空白脂质体、microRNA-34 a和miLPs-34 a。每组设3组重复，每孔加入相当于miRNA的量为150 nM的脂质体（或空白脂质体）。以PBS为阴性对照组，统计肿瘤球体积大小变化情况。

1.2.6 肺癌异位肿瘤模型的构建及miLPs-34 a对肿瘤的抑制作用 A549肿瘤干细胞经胰酶消化，离心后将其悬浮于DMEM培养液中，计数调节浓度至5×107个/mL。取4～6周龄，体重20～25 g的雄裸鼠，将准备好的A549肿瘤干细胞悬浊液皮下接种于裸鼠背部，每只裸鼠接种0.1 ml细胞悬浊液。接种后1～2周可见背部长出肿瘤块，证明接种成功。

待肿瘤直径达到约10 mm左右时优选15只荷瘤裸鼠随机分为3组，每组5只，分别为microRNA-34 a组、miLPs-34 a组和PBS组，给药量以miRNA量计10µg/20 g。荷瘤裸鼠每天观察其活动度和饮食习惯，每2天给药一次并用游标卡尺测量其肿瘤大小（mm3），肿瘤体积按照公式V=长×宽2×0.52计算[9]，计算各天相对于初始0天的肿瘤体积比： 肿瘤体积变化率（%）=肿瘤体积 /（肿瘤初始体积）×100%。

1.3 统计学方法 实验数据以“均数±标准差”表示，SPSS 11.0统计软件进行数据分析，计量资料多组间比较用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 microRNA-34 a脂质体的粒径、电位以及包封率 制备得到的miLPs-34 a的粒径为（136.55±11.4）nm，电位为（21.45±4.55）mV，microRNA-34 a的包封率为94.6%。

2.2 microRNA-34 a脂质体具有良好的血清稳定性 血清稳定性实验结果表明，miLPs-34 a在50%的血清中的透光率与其在PBS中的透光率的比值均接近100%，表明脂质体24 h在血清中具有较好的稳定性。

2.3 A549肺癌干细胞对microRNA-34 a脂质体摄取 细胞摄取实验结果见图1。肿瘤干细胞对miLPs-34 a的摄取量随着时间的延长而增加，miLPs-34 a在4 h摄取效率（31.5%±2.3%）是2 h（18.1%±2.8%）的1.74倍，差异具有统计学意义（t=10.36，P=0.034）；脑肿瘤干细胞对miLPs-34 a的摄取效率4 h（31.5%±2.3%）约是游离microRNA-34 a 4 h（10.2%±1.0%）的3.1倍，差异具有统计学意义（t=10.22，P=0.003）。

图1 肺癌干细胞对miLPs-34 a和microRNA-34 a的摄取效率比较。**P＜0.01，与4 h时 microRNA的摄取相比；△P＜0.05，与2 h时miLPs-34 a的摄取相比Fig.1 The cellular uptake of miLPs-34 a and microRNA-34 a in vitro at 2 h and 4 h incubation**P＜0.01，compared with the microRNA uptake in 4 h；△P＜0.05，compared with the miLPs-34 a uptake in 2 h

2.4 microRNA-34 a脂质体抑制肿瘤干细胞的增殖和肿瘤球的生长 MTT实验结果见图2。miLPs-34 a和microRNA-34 a均能显著抑制肿瘤细胞的增殖，且对肿瘤干细胞的增殖抑制率随着时间的延长而增长，miLPs-34 a在48 h对肺癌干细胞的抑制率（69.0%±12.3%）是24 h（45.1%±10.7%）的1.53倍，差异具有统计学意义（t=12.36，P=0.024）；在给药48 h后，miLPs-34 a对肿瘤细胞的增殖抑制率（69.0%±12.3%）是microRNA-34 a（29.1%）的2.37倍，差异具有统计学意义（t=14.34，P=0.000）。空白脂质体对肿瘤干细胞也有一定的毒性。miLPs-34 a对肿瘤球的抑制实验结果显示，给药7天后，PBS组肿瘤球持续生长，体积增大1.45倍，microRNA-34 a组肿瘤球体积增大到原体积的1.32倍，miLPs-34 a组肿瘤球体积减小到原体积的77%。与PBS组相比，microRNA-34 a和miLPs-34 a能抑制肿瘤球的生长，这说明microRNA-34 a对肺癌干细胞增殖具有良好的抑制效果，脂质体包载能够保护microRNA-34 a，增强对肺癌干细胞的抑制作用。miLPs-34 a对肿瘤球的生长抑制能力显著强于microRNA-34 a，差异具有统计学意义（P=0.007）。各组不同天数间重复测量数据的方差分析结果显示， PBS、microRNA-34 a、miLPs-34 a各时间段间比较，差异均有统计学意义（F=10.32、10.58、10.55，P=0.031、0.039、0.030，见表1）。

图2 肺肿瘤干细胞MTT实验中的存活率**P＜0.01，与空白脂质体和microRNA-34 a比较；△P＜0.05，与24 h时肺癌干细胞存活率比较Fig.2 The cell viability of lung cancer stem cells at various drugs after 24 h and 48 h treatments**P＜0.01，compared with blank liposome and microRNA-34 a；△P＜0.05，compared with The cell viability of lung cancer stem cells in 24 h

表1 给药后肿瘤球体积变化Tab.1 The change ratio of tumor spheroid after 7 days

2.5 microRNA-34 a脂质体抑制肿瘤球和荷瘤裸鼠肿瘤的生长 肿瘤直径达到约10 mm左右时用于后续实验。miLPs-34 a对荷瘤裸鼠每3天给药一次，记录裸鼠肿瘤体积的大小，与初始肿瘤体积的比值计算相对肿瘤大小。荷瘤裸鼠的治疗实验结果显示，给药后第21天，PBS组肿瘤体积增长为原体积的2.15倍，microRNA-34 a肿瘤体积增长为原肿瘤体积的1.85倍，而miLPs-34 a组肿瘤体积只增长为原体积1.52倍，这说明miLPs-34 a对裸鼠肿瘤生长的抑制能力显著强于microRNA-34 a，二者差异具有统计学意义（P=0.021）。各组不同天数间重复测量数据的方差分析结果显示，PBS、microRNA-34 a、miLPs-34 a各时间段间比较，差异均有统计学意义（F=18.56、17.64、18.04，P=0.025、0.028、0.027，见表2）。

表2 各给药组对荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制效果Tab.2 The tumor volume of initial after treatment with different drugs

3 讨论

有观点认为，肿瘤治疗失败或者肿瘤复发的主要原因是肿瘤干细胞具有耐药和耐辐射的特性，且肿瘤干细胞长期处于休眠状态[10]。因此杀伤肿瘤干细胞成为了肿瘤治疗的一种新途径。肿瘤干细胞具有强大的自我更新能力、分化能力和致瘤能力等特点[2-3]。因此，对肿瘤干细胞进行靶向给药成为了一种理想的肿瘤治疗方法。在包括肺癌的多种癌症中CD44已经被证明可以作为一种肿瘤干细胞亚群的重要标记分子[11]。王教等[12]将microRNA-34 a包载于商品化脂质体lipofectamine中能够有效抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖。最近研究强调miR-34 a能够通过直接抑制肿瘤干细胞的标记物CD 44的活性，从而作为抑制肿瘤干细胞分化和转移的调节剂[13]，Sanjun Shi等[14]采用固体脂质纳米粒包载miR-34a后实现了对小鼠黑色素瘤的靶向抑制。这就说明CD 44是miR-34a的直接作用的靶标。由于在抑制肿瘤干细胞分化中的重要作用，miR-34 a在肺癌治疗中具有广阔的前景[15]。本研究以CD44为标记物的肺癌干细胞为靶标，考察miLPs-34a抗肿瘤干细胞的作用。

本研究采用薄膜分散法制备了空白阳离子脂质体，利用miRNA与阳离子脂质体的静电吸附作用孵育得到载microRNA-34a的脂质体。脂质体的粒径在135 nm左右，包封率大于90%。肺癌干细胞对脂质体的摄取效率是游离miRNA的3.1倍，这可能是由于以下两方面原因：（1）由于阳离子脂质体所带的正电荷能够介导脂质体入胞，增强了入胞效率；（2）脂质体与细胞膜通过膜融合作用介导脂质体入胞。肺癌干细胞的增殖抑制实验结果表明，空白阳离子脂质体由于具有较强正电荷，对肿瘤干细胞有一定的毒性。裸鼠肺癌肿瘤抑制实验结果表明，经过脂质体包载后，microRNA-34a对肿瘤的抑制作用得到了增强。这是由于脂质体包载后能够保护miRNA在血液循环过程中不被核酸酶破坏。综上所述，本研究构建了载microRNA-34a的脂质体，通过体外肿瘤干细胞增殖抑制实验、肿瘤球生长抑制试验和体内肿瘤生长抑制实验证实miLPs-34a能够有效的靶向抑制肺癌干细胞和肺肿瘤，miLPs-34a是一种潜在的有效的肺癌干细胞靶向给药系统。

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The study of microRNA-34 a loaded liposome inhibit lung cancer stem cells

ZHAO Xin
（Department of Respiration, The First Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University， Xinxiang 453000, China）

ObjectiveTo preparemicroRNA-34 a loaded liposome and evaluate the targeting ef fi ciency for lung cancer stem cells and effect on the treatment of lung cancer。MethodThe liposomes were prepared by thin fi lm hydration method. The particle size，Zeta potential and entrapment ef fi ciency were evaluated. Stability of liposome in serum was evaluated. The ef fi ciency of cellular uptake on lung cancer stem cells in vitro was evaluated. The antiproliferation ef fi ciency of miLPs-34 a was evaluated by MTT assay. Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of miLPs-34 a. Lung cancer stem cells were used to build orthotopictumor model, which were used to evaluate the effect of anti-cancer。ResultsThe particle diameter of the miLPs-34 a was (136.55±11.4) nm with the Zeta potential of (21.45±4.55) mV. The entrapment ef fi ciency of microRNA-34 awas 94.6%.the results demonstrated that the liposomes could keep stable in 50% serum for 24 h. miLPs-34 a uptaken by lung cancer stem cells were 3.1 times higher than that of microRNA-34 a(P＜0.01). The MTT assay con fi rmed strong inhibitory effect of miLPs-34 a than microRNA-34 a(P＜0.01). the inhibition of tumor spheroid con fi rmed strong inhibitory effect of miLPs-34 a than microRNA-34 a(P＜0.01). The anti-tumor of miLPs-34 a was much more effectively than microRNA-34 a(P＜0.01).Conclusion the microRNA-34 a loaded liposome could target to lung cancer stem cells and inhibit the proliferation of lung cancer stem cell. MiLPs-34 a, as a new nanometer drug, has a special application value for the therapy of lung cancer stem cell.

tumor stem cell；microRNA-34 a；liposome；lung cancer

R 734.2;R 730.5

A

1005-1678(2014)01-0068-04

肺癌作为严重威胁人类健康的头号恶性肿瘤，国内每年新发肺癌约50万，到2025年预计我国每年将有100万肺癌患者。摆在临床医师特别是肿瘤治疗医师面前的任务是极其繁重和艰巨的[1]。近年来，随着肿瘤分子生物学的研究发展，越来越多的研究表明在肿瘤组织中存在着数量稀少的一类癌细胞，在肿瘤形成过程中充当干细胞的角色，具有自我更新、增殖和分化的潜能，虽然数量少，却在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着重要作用，由于其众多性质与干细胞相似，所以这些细胞被称为肿瘤干细胞（Cancer stem cells，CSCs）[2-3]。现已经证明了多种肿瘤具有肿瘤干细胞，包括脑胶质瘤、胰腺癌、头颈瘤、结肠癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌[4]以及肺癌[5]等。

MicroRNA-34 a（miR-34 a）是与人类癌症的发生和发展相关的最突出的内源性miRNA之一，它是一种肿瘤抑制基因，能够有效的抑制肿瘤的发展[6]。然而， miRNA是一种不稳定的亲水分子，容易受到核酸酶的攻击而失活，因此其治疗效果会受到影响。脂质体是一种将药物包封于类脂双分子层形成的脂膜中所制成的超微球状载体制剂，能够将miRNA包载于脂质体内部，一方面使miRNA能够靶向到达肿瘤组织，另一方面也能够有效保护miRNA免受体内核酸酶的破坏。本研究构建了载microRNA-34 a脂质体（miLPs-34 a），研究其对肺癌干细胞的靶向性以及对肺癌干细胞的生长抑制作用。

赵欣，女，硕士，主治医师，研究方向：呼吸系统疾病以及肺部肿瘤，E-mail：529827419@qq.com。