灯盏细辛注射液对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的保护作用研究

王斌，马瑜红，胡清茹，田林燕，张华勋，阮耀，梁桂娜

（南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473000）

灯盏细辛注射液对大鼠肾脏缺血-再灌注损伤的保护作用研究

王斌，马瑜红，胡清茹，田林燕，张华勋，阮耀，梁桂娜

（南阳医学高等专科学校，河南 南阳 473000）

目的探讨灯盏细辛注射液对缺血-再灌注肾脏损伤的保护作用，为临床防治肾缺血-再灌注损伤提供理论依据。方法36只SPF级健康雄性SD大鼠，随机均分为3组（n=12）。A组：缺血-再灌注组;B组：灯盏细辛注射液预处理组;C组：假手术组。A、C组大鼠腹腔注射生理盐水，B组大鼠腹腔注射灯盏细辛注射液12 mg/kg。14天后比较3组大鼠肾功能指标、肾抗氧化指标、肾组织细胞凋亡指数以及肾组织Bcl-2、Bax表达情况。结果B组血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐(serum creatinine，SCr)显著低于A组（P＜0.05），且显著高于C组（P＜0.05）;同时，B组超氧岐化酶（superoxide dismutase，SOD）显著高于A组（P＜0.05）而显著低于C组（P＜0.05），B组丙二醛（malondialdehyde，MDA）显著低于A组（P＜0.05）而显著高于C组（P＜0.05）;肾组织细胞凋亡指数结果显示：B组细胞凋亡指数AI极显著低于A组（P＜0.01）而显著高于C组（P＜0.01）;肾组织Bcl-2、Bax免疫组化染色结果显示：B组Bcl-2表达显著高于A组与C组（P＜0.01），B组Bax表达显著低于A组（P＜0.05）而显著高于C组（P＜0.01），B组Bcl-2/Bax值显著高于A组与C组（P＜0.05）。结论灯盏细辛注射液可能通过抗氧化和抗凋亡作用对肾脏缺血-再灌注损伤起到保护作用。

灯盏细辛注射液;肾脏;缺血-再灌注

1.2 实验分组及造模 取36只SPF级健康雄性SD大鼠，随机分为3组，每组12只。A组：缺血-再灌注组；B组：灯盏细辛注射液预处理组；C组：假手术组。A、C组大鼠腹腔注射生理盐水，B组大鼠腹腔注射灯盏细辛注射液12 ml/kg。各组每天给药1次，连续14 d。第14天给药后1 h，用10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉大鼠，行腹正中切口，暴露双侧肾脏并游离双侧肾蒂，用0号线结扎右肾肾蒂，切除右肾。而A、B组用无创动脉夹夹闭左侧肾动脉60 min，然后开放动脉血流。若肾脏由暗红变为鲜红，表明再灌注成功，随后缝合腹腔。C组不夹闭左侧肾蒂，仅切除右侧肾脏，暴露60 min后再关闭腹腔。各组于24 h后麻醉大鼠，采血并摘取左肾。血标本以4000 r/min离心10 min，分离血清，置-20℃保存用于测定血尿素氮（BUN）和血肌酐(SCr)。取部分肾组织用40 g/L甲醛固定以制备石蜡切片。

1.3 检测指标 (1)肾功能测定：用紫外分光光度计测定BUN（二乙酰-肟显色法）和SCr（碱性苦味酸比色法）水平；(2)肾抗氧化指标检测：按照试剂盒要求测定MDA含量和SOD活性；(3)肾组织细胞凋亡检测：采用TUNEL检测，操作步骤按照TUNEL试剂盒说明书进行， 使用DAB试剂盒显色，光镜观察凋亡细胞，若细胞核中有棕黄色颗粒则为阳性细胞。在阳性表达的分布区域、。使用200倍随机选择5个无重叠视野，对阳性细胞进行计数，计算细胞凋亡指数（AI)以凋亡阳性细胞数占总细胞数的百分比表示：凋亡阳性细胞/总细胞数×100%。(4)肾组织Bcl-2、Bax免疫组化染色：操作步骤按照Bcl-2和Bax试剂盒进行，采用DAB试剂盒显色。在光镜下观察，若胞质中含有棕色颗粒者作为阳性细胞。

1.4 统计学方法 采用统计学软件SPSS 19.0对数据进行分析处理，正态计量资料采用“x±s”表示，2组间比较采用两样本t检验，多组之间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾功能测定结果 尿素氮（BUN）3组比较差异具有显著性意义（F=91.287，P=0.000）；血肌酐（SCr）值3组比较差异具有显著性意义（F=227.472，P=0.000，见表1）。

表1 各组大鼠肾功能测定结果比较（n=12）Tab. 1 Comparison of renal function test results in three groups（n=12）

2.2 各组大鼠肾抗氧化指标检测结果 3组大鼠肾组织匀浆中超氧岐化酶（SOD）比较差异具有显著性意义（F=46.398，P=0.000）；3组大鼠肾组织匀浆中丙二醛（MDA）比较差异具有显著性意义（F=158.392，P=0.000，见表2）。

表2 各组大鼠肾抗氧化指标比较结果（n=12）Tab.2 Comparison of renal antioxidant index results in three group（n=12）

2.3 肾组织细胞凋亡监测结果 A组大鼠肾组织细胞凋亡指数显著高于B组、C组（F=262.381，P=0.000，见表3、图1)。

表3 各组大鼠肾组织细胞凋亡指数比较（n=12）Tab.3 Comparison of renal cell apoptosis index results in three group（n=12）

图1 各组肾小管上皮细胞凋亡TUNEL染色图①A组：缺血-再灌注组；②B组：灯盏细辛注射液预处理组；③C组：假手术组Fig. 1 TUNEL staining results of renal tubular epithelial cell apoptosis in each group①Group A：ischemia reperfusion group；②Group B：Erigeron breviscapus injection preconditioning group；③ Group C：sham operation group

2.4 大鼠Bcl-2、Bax表达情况 C组大鼠Bcl-2和Bax表达显著低于A组、B组（P＜0.05）；A组大鼠Bcl-2/Bax表达显著低于B组、C组（P＜0.05，见表4）。

表4 各组大鼠Bcl-2、Bax表达的比较结果（n=12）Tab.4 Comparison of Bcl-2, Bax expression results in three groups（n=12）

3 讨论

灯盏花属于菊科短亭飞蓬属植物，灯盏细辛注射液中其主要的成分有灯盏花乙素、二咖啡酰奎宁酸酯、焦袂康酸、芹菜素、高黄芩素等黄酮类的化合物。有药理研究表明其具有着降低血液粘稠度、舒张血管、增加脑供血、改变血液流动性的功能，同时还能够改善机体微循环、保护梗死区的组织、为梗死区增加血氧供应并促进梗死区功能的恢复[3]。临床实践证明，灯盏细辛注射液能够较好地治疗肾脏缺血-再灌注损伤，但是其作用机制仍不清楚。

肾脏是一种高灌注器官，因此肾脏对于机体的缺血是非常敏感的，当机体血容量不足或者进行相关的手术时需要阻断肾脏血流，当机体血流灌注恢复以后则可能发生肾脏缺血-再灌注损伤[4-5]。随着临床各种肾脏手术以及肾移植手术的开展，如何有效预防以及治疗肾脏缺血-再灌注损伤成为了临床工作中的一个难题，也成为了科研关注的一个焦点。本研究探讨灯盏细辛对缺血-再灌注肾脏损伤的保护作用，为临床防治肾缺血-再灌注损伤提供科学的理论依据。

BUN以及SCr为机体内的代谢产物，当机体的肾脏功能损伤到达一定程度时，由于机体失去了代偿能力，从而造成了血液中BUN以及SCr的含量升高，因此血液中BUN以及SCr升高表明了肾脏的损伤更加严重[6-8]。本研究结果显示，缺血-再灌注后大鼠血清BUN、SCr显著升高，表明造模成功。灯盏细辛可显著降低缺血-再灌注大鼠血清BUN和SCr水平，提示灯盏细辛注射液对肾功能具有保护作用[9]。SOD是一种自由基清除剂，能够有效反映出机体清除氧自由基的能力，通过测定SOD的活性能够反映出肾脏抗脂质过氧化的能力；而MDA是一种脂质过氧化的代谢产物，能够反映出肾脏其脂质过氧化的程度[10-11]，研究结果显示，B组超氧岐化酶（SOD）显著高于A组（P＜0.05）而显著低于C组（P＜0.05），B组丙二醛（MDA）显著低于A组（P＜0.05）而显著高于C组（P＜0.05），表明了灯盏细辛注射液能够增强肾脏抗氧化的能力，从而起到保护肾脏缺血-再灌注损伤的作用。

本研究采用TUNEL法检测肾小管上皮细胞的凋亡，该方法是目前较为常用的一种方法，其灵敏度较高，且能够准确标记出凋亡细胞[12-13]，研究结果显示，B组细胞凋亡指数AI极显著低于A组（P＜0.01）而极显著高于C组（P＜0.01），表明了肾脏缺血-再灌注损伤将诱导细胞凋亡增加，而灯盏细辛注射液能够有效减轻细胞的凋亡。由于细胞凋亡是在基因的调控作用下所产生的一种自我消亡的过程，本研究测定抗调亡基因Bcl-2蛋白以及促调亡基因Bax蛋白，Bcl-2可抑制细胞凋亡，而Bax加速细胞凋亡，Bcl-2以及Bax的比率决定了细胞的存活还是促进其凋亡[14-15]，研究结果显示，肾组织Bcl-2、Bax免疫组化染色结果显示，B组Bcl-2表达极显著高于A组与C组（P＜0.01），B组Bax表达显著低于A组（P＜0.05）而极显著高于C组（P＜0.01），B组Bcl-2/Bax值显著高于A组与C组（P＜0.05），提示灯盏细辛注射液通过上调Bcl-2而下调Bax，使

Bcl-2/Bax的比值上升，减少细胞的凋亡，发挥保护肾脏缺血-再灌注损伤的作用。

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Study of protective effect of erigeron injection on renal ischemia-reperfusion injury

WANG Bin, MA Yu-hong, HU Qing-ru, TIAN Lin-yan, ZHANG Hua-xun, RUAN Yao, LIANG Gui-na
（Nanyang Medical College，Nanyang 473000, China）

ObjectiveTo investigate the protective effect of breviscapine on ischemia-reperfusion renal injury, which provides scientific theoretical basis for clinical prevention and treatment of renal ischemia-reperfusion injury。Method36 SPF male healthy SD rats were randomly divided into 3 groups, 12 rats in each group. Group A was ischemia-reperfusion group, group B was erigeron breviscapus injection preconditioning group, and group C was sham operation group. Rats in group A and C were injected with normal saline, while rats in group B were given 12 ml/ kg erigeron breviscapus injection by intraperitoneal injection., After 14 days, renal function, renal antioxidant indexes, renal cell apoptosis indexes and expression of Bcl-2, Bax in renal tissue of three groups were compared。ResultsThe indexes of renal function showed that blood urea nitrogen (BUN) and Serum creatinine (SCr) in group B were signi fi cantly lower than group A (P＜0.05), but signi fi cantly higher than group C (P＜0.05). Renal antioxidant indexes showed that superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in group B were signi fi cantly higher than group A (P＜0.05), but signi fi cantly lower than group C(P＜0.05). The index of renal cell apoptosis showed that the apoptosis index AI in group B was signi fi cantly lower than group A (P＜0.01), but signi fi cantly higher than group C (P＜0.01). The results of immunohistochemical staining showed that the expression of Bcl-2 in group B were signi fi cantly higher than that of group A and group C (P＜0.05), and the expression of Bax in group B was signi fi cantly lower than that in group A (P＜0.05) while signi fi cantly higher than group C (P＜0.01). The ratio of Bcl-2/Bax in group B was signi fi cantly higher than group A and group C (P＜0.05)。ConclusionErigeron Breviscapus Injection may have a protective role on renal ischemia reperfusion injury though antioxidant and anti-apoptosis.

erigeron breviscapus injection; kidney; ischemia reperfusion

R 285.5

A

1005-1678(2014)01-0038-03

肾缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）指的是缺血肾脏的血液供应恢复后，可加重原有的单纯缺血性损伤。在临床工作中IRI是导致患者缺血性急性肾衰竭的一个重要原因。此类患者的病死率高，即便存活，患者也存在不同程度的慢性肾功能损伤。有研究结果显示灯盏细辛注射液能够降低损伤血瘀证模型大鼠其血清中的炎症因子(如IL-1和TNF-α)的含量，从而减轻炎症的程度；同时也具有止痛、抗凝以及提高免疫力、抗氧化等作用，并对脑缺血-再灌注大鼠的脑组织具有着明显的保护作用[1-2]。在临床工作中将此药物运用于难治性肾病综合征、IgA肾病以及慢性肾小球肾炎具有着良好的效果，但是在国内的研究中该药物对肾缺血-再灌注的相关报道较少。本研究探讨灯盏细辛对缺血-再灌注肾脏损伤的保护作用，并探讨作用机制，为临床防治肾缺血-再灌注损伤提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备 灯盏细辛注射液购自云南生物谷灯盏花药业有限公司（国药准字Z 53021569），超氧岐化酶（SOD）以及丙二醛（MDA）检测试剂盒、蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。所用仪器主要包括全自动生化分析仪（日立7020）、紫外分光光度计（TU-1901），BM－Ⅷ生物组织包埋机及冷冻台（孝感市宏业医用仪器有限公司）、病理图像分析仪（Leica DMR+Q 550型）、显微镜（Olympus BX-41）、荧光显微镜(Nikon E 200 F)。

南阳市科技攻关项目（2012 GG 073）

王斌，男，硕士，讲师，研究方向：中药药理与临床药理学，E-mail：baomaxl@126.com。