黄 燕 丁 罡 陈 峰 陆云姝 张 明 梁洪享 吴克瑾
乳腺癌是目前最常见的女性恶性肿瘤,是妇女死亡的头号杀手,严重威胁女性的身心健康[1]。TBX3基因是属于调控发育相关的转录因子,它与肿瘤的发生发展关系密切[2],它在乳腺癌、肝癌、肺癌、恶性黑色素瘤等多种肿瘤中高表达[3-6]。TBX3基因与乳腺癌的分子指标ER、PR、Her-2的相关性研究已成为乳腺癌研究的热点之一[5-6],但它与乳腺癌分子亚型的相关性研究较少,尚无有相关报道,TBX3与乳腺癌的分子亚型及预后的关系尚不明确。本实验研究TBX3基因在乳腺癌组织中的表达水平与ER、PR、Her-2、Ki-67等指标表达关系的基础上,进一步研究它与乳腺癌分子亚型的相关性,现报告如下。
选取2011年1月-2013年12月在上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院行手术切除的102例乳腺癌病例,临床资料完整,术前未行放化疗或靶向治疗,病理标本保存完好。102例乳腺癌患者均为女性,年龄38~93岁,平均年龄61.90岁,≤65岁60例,>65岁42例;临床分期(102例中96例行术后分期,6例因行单纯切除术未能分期):Ⅰ期45例,Ⅱ期31例,Ⅲ期20例;月经情况:未绝经24例,绝经78例;免疫组化:ER(-)32例,ER(+)70例;Her-2(-)40例,Her-2(+)62例;Ki-67低表达(<14%)49例,Ki-67高表达(≥14%)53例。luminal A型40例、luminal B型33例、Her-2阳性型18例、Basal-like型11例。并选择22例同期行手术的良性乳腺肿瘤及10例乳腺癌切缘阴性组织分别作为对照组。所有的标本均经10%甲醛固定、常规石蜡包埋、切片备用。
人TBX3多克隆抗体:abcam公司,英国。免疫组化二步法染色严格按照试剂盒说明书进行操作,抗原修复采用高压修复法,阴性对照组:PBS磷酸缓冲液代替一抗作为阴性对照。
免疫组织化学反应结果的评判标准参考许良中[7]的免疫组化评价标准,光镜下随机观察4~5个不重叠的高倍(×200)视野,计数100~200个细胞,细胞染色阳性表达为境界清晰、突出于背景的棕黄色或棕褐色颗粒。根据阳性细胞数和着色强度进行半定量分析,阳性细胞数:无阳性细胞为0分,1%~30%为1分,31%~70%为2分,71%~100%为3分;着色强度:不着色为0分,浅棕色为1分,棕黄色为2分,棕揭色为3分。两项分数累计:0分为阴性(-),1、2分为弱阳性(+),3、4分为阳性(++),5、6分为强阳性(+++)。结果分为阴性(-)及阳性(+~+++)两组进行分析。
应用SAS 8.02统计软件对数据进行分析,乳腺癌与良性组织TBX3表达率的比较,临床及病理因素中TBX3表达率的差异均采用χ2检验,分子分型中各组之间的多重比较采用Nemenyi检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
TBX3主要定位于细胞核,其阳性表达为境界清晰、突出于背景的黄色或棕黄色。结果显示TBX3在乳腺癌与乳腺良性肿瘤组织中的表达存在统计学显著差异(P=0.0052<0.05),见表1。
表1 乳腺癌与乳腺良性肿瘤组织中TBX3表达(例,%)
102例乳腺癌组织中,TBX3表达阳性率为75.49%;10例切缘阴性的癌旁组织中,TBX3表达阳性率为30.00%;经统计学分析显示,TBX3在乳腺癌与切缘阴性的癌旁组织中的表达存在统计学显著差异(P=0.0055<0.05)
本组结果显示,TBX3表达与患者年龄、有无绝经、Her-2状态无显著相关性(P>0.05),与乳腺癌临床分期、ER状态及Ki-67值有显著相关性(P<0.05),见表2。
表2 TBX3表达与乳腺癌临床病理参数的关系(例,%)
本组结果经统计学分析显示在不同分子亚型乳腺癌组织中TBX3表达存在统计学差异(P值=0.0200,P<0.05),见表3,Basal-like型乳腺癌TBX3阳性表达率明显低于另外3种分子亚型,结果还显示TBX3表达Basal-like型与luminal A型、luminal B型比较有统计学差异(P<0.05);luminal A型与luminal B型、Basal-like型与Her-2阳性型、luminal A型与Her-2阳性型、luminal B型与Her-2阳性型间TBX3表达比较,无显著性差异(P>0.05)。
表3 不同分子亚型乳腺癌中TBX3表达情况(例,%)
乳腺癌是一个多基因突变驱动的疾病,目前新发现的与乳腺癌相关的癌基因包括AKT2,ARID1B,CASP8,CDKN1B,MAP3K1,MAP3K13,NCOR1,SMARCD1 和TBX3等[8-9]。TBX基因家族也称T-box,它具有高度保守的DNA结合区—T区,T区具有回文结构的双链DNA的两个位点,其中的一个位点与靶基因的启动子特点序列相结合形成半位结合体,这个半位结合体通过与不同的转录因子结合发挥不同的作用[10]。人类对TBX3的认识首先是在对尺骨-乳腺综合症(ulnar-mammary syndrome,UMS)的研究中逐渐发现的,UMS是由于TBX3突变或缺失引起的一种严重的家族性显性遗传病,是由于TBX3基因发生点突变,引起所表达的TBX3蛋白碳端的抑制区缺失,导致TBX3功能障碍,临床上主要表现为乳腺、四肢发育障碍伴心脏畸形等先天性缺陷[11-13]。
TBX3不但与乳腺的发育有关,还与乳腺癌的形成和进展相关,国内学者[14]使用荧光定量PCR的方法比较了51例新鲜乳腺癌及相应的癌旁组织TBX3表达的情况,发现TBX3基因在癌组织中的表达高于癌旁组织,叶海英等[15]研究发现乳腺癌组织中Tbx3基因的阳性率为73.58%,明显高于正常乳腺组织中的阳性率14.29%,ER阳性乳腺癌组织中TBX3基因的阳性率为84.38%,明显高于ER阴性的阳性率57.14%;有淋巴结转移乳腺癌组织中TBX3基因的阳性率为86.21%,明显高于无淋巴结转移的阳性率58.33%(14/24);Her-2阳性乳腺癌组织中TBX3基因的阳性率为93.75%,明显高于Her-2阴性的阳性率64.86%,Douglas等[5]研究亦表明TBX3在分期较晚的乳腺癌中高度表达,这说明TBX3与乳腺癌有关,亦初步证实了TBX3与乳腺癌分子标记物ER、PR、Her-2之间的相关性。我们的研究结果与邓军[6]、叶海英等[15]的研究结论相仿,认为TBX3基因与乳腺癌有关,并且在中晚期、ER阳性、Ki-67过表达的乳腺癌中高表达,这提示TBX3基因与乳腺癌的预后因素有关。
乳腺癌根据分子水平为基础的分子亚型已经广泛应用于临床,并作为指导制定治疗方案、判断疗效、预测预后的重要标准之一,目前临床上常用的乳腺癌分子分型方法为2011年《St.Gallen早期乳腺癌初始治疗国际专家共识》中提出的4分法:luminal A型、luminal B型、人表皮生长因子受体2过表达型、基底细胞样型。具体每型的分子特征是:①luminal A型:免疫组织化检测结果为ER 阳性或/和PR阳性,Her-2阴性,Ki-67<14%[16]。luminal A型是乳腺癌最为常见的类型,其发病率占乳腺癌 40%~50%,并且预后较其它亚型最好[17]。②luminal B型:免疫组织化检测结果为ER阳性或PR阳性,Her-2阳性;或者ER阳性或/和PR阳性,Her-2阴性,Ki-67≥14%。luminal B 型发病率约占乳腺癌的 8%,复发风险最高[18]。③Her-2过表达型:分子特征为ER、PR阴性,HER-2 阳性,Ki-67多为高表达。此型患者的 5 年无病生存和总生存率最差[19]。④基底细胞样型乳腺癌(basal-like breast carcinoma,BLBC):BLBC的分子特征为ER(-)和 PR(-)/HER-2(-),主要表现为三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC),即:雌激素受体(ER) 、孕激素受体(PR) 、人表皮生长因子受体 2(Her-2) 均为阴性表达的乳腺癌。占乳腺癌的 8%~20%,临床表现为高度侵袭性,较多发生局部或远处转移,较少发生淋巴结转移,预后最差[20]。本研究发现,TBX3在乳腺癌四种分子亚型中的表达是不同的,从结果数据可以看出:TBX3在Basal-like型乳腺癌中低表达,在luminal A型、luminal B型乳腺癌中高表达,这提示TBX3与luminal A型、luminal B型乳腺癌的关系密切,可作为luminal型乳腺癌恶性标志物之一,而对Basal-like型关系不密切,不能作为其恶性标志物。TBX3基因与乳腺癌预后有关,但是否能作为乳腺癌预后因子之一,还有待于进一步随访及行预后分析。
综上所述,TBX3基因与乳腺癌的关系密切,TBX3在乳腺癌组织中的表达与肿瘤分期、ER、Ki-67的状态、分子亚型有关,但由于肿瘤信号途径的错综复杂,TBX3在肿瘤中形成、发展、转移等过程中的信号通路仍不十分清晰,相信随着对TBX3基因进一步深入的研究,TBX3基因将来有望成为治疗肿瘤的新靶点[21]。
[1] Benson JR,Jatoi I.The global breast cancer burden〔J〕.Future Oncol,2012,8(6):697-702.
[2] 邓 军,刘友生.Tbx3基因功能研究及其在肿瘤演进中的作用〔J〕.第三军医大学学报,2005,27(4):363-365.
[3] 刘 楠,董千泽,王恩华,等.TBX3在非小细胞肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响〔J〕.中国医科大学学报,2012,41(4):360-363.
[4] Burgucu D,Guney K,Sahinturk D,et al.Tbx3 represses P-TEN and is over-expressed in head and neck squamous cell carcinoma〔J〕.BMC Cancer,2012,12:481.
[5] Douglas NC,Papaioannou VE.The T-box transcription factors TBX2 and TBX3 in mammary gland development and breast cancer〔J〕.J Mammary Gland Biol Neoplasia,2013,18(2):143-147.
[6] 邓 军,刘友生,黄涛生,等.人乳腺癌组织中Tbx3基因表达变化及其意义〔J〕.解放军医学杂志,2005,30(6):512-514.
[7] 徐良中,杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准〔J〕.中国癌症杂志,1996,6(04):229-231.
[8] Stephens PJ,Tarpey PS,Davies H,et al.The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer〔J〕.Nature,2012,486(7403):400-404.
[9] Nik-Zainal S,Alexandrov LB,Wedge DC,et al.Mutational processes molding the genomes of 21 breast cancers〔J〕.Cell,2012,149(5):979-993.
[10] Tada M,Smith JC.T-targets:clues to understanding the fu-nctions of T-box proteins〔J〕.Dev Growth Differ,2001,43(1):1-11.
[11] Davenport TG,Jerome-Majewska LA,Papaioannou VE.Ma-mmary gland,limb and yolk sac defects in mice lacKing Tbx3,the gene mutated in human ulnar mammary syndrome〔J〕.Development,2003,130(10):2263-2273.
[12] Bamshad M,Lin RC,Law DJ,et al.Mutations in human TBX3 alter limb,apocrine and genital development in ulnar-mammary syndrome〔J〕.Nat Genet,1997,16(3):311-315.
[13] Linden H,Williams R,King J,et al.Ulnar Mammary syndrome and TBX3:expanding the phenotype〔J〕.Am J Med Genet A,2009,149A(12):2809-2812.
[14] 陈忠华,吕光明,季天海,等.TBX3基因mRNA在乳腺癌中表达的检测及其意义〔J〕.南方医科大学学报,2009,29(1):87-89.
[15] 叶英海,陈琦凡,叶正亮,等.Tbx3基因在乳腺癌组织中的表达和临床意义〔J〕.中国医师进修杂志,2010,35(14):1-2.
[16] Prat A,Cheang MC,Martín M,et al.Prognostic significance of progesterone receptor-positive tumor cells within immunohistochemically defined luminal A breast cancer〔J〕.J Clin Oncol,2013,31(2):203-209.
[17] Dawood S,Hu R,Michelle D,et al.Defining breast cancer prognosis based on molecular phenotypes:results from a large cohort study〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2011,126(1):185-192.
[18] Cancello G,Maisonneuve P,Rotmensz N,et al.Progesterone receptor loss identifies Luminal Bbreast cancer subgroups at higher risk of relapse〔J〕.Ann of Oncol,2012,24(3):661-668.
[19] Xue C,Wang X,Peng R,et al.Distribution,clinicopathologic features and survival of breast cancer subtypes in Southern China〔J〕.Cancer Sci,2012,103(9):1679-1687.
[20] Dey N,Smith BR,Leyland-Jones B.Targeting basal-like b-reast cancers〔J〕.Curr Drug Targets,2012,13(12):1510-1524.
[21] Lu J,Li XP,Dong Q,et al.TBX2 and TBX3:the special v-alue for anticancer drug targets〔J〕.Biochim Biophys Acta,2010,1806(2):268-274.