低压低氧预处理对加速度暴露大鼠心肌损伤的保护作用

叶博++++++张国荣++++++黄俊梅++++++尹哲++++++陶磊

[摘要] 目的 从心肌抗氧化系统及一氧化氮（NO）代谢通路研究低压低氧预处理对加速度环境下心肌细胞病理生理变化的影响，解释航空加速度环境下心肌组织的损伤机制，探讨低压低氧预处理的保护机制。 方法 24只雄性SD大鼠随机分为3组（n=8），C组为空白对照组，HHP+10 Gz组为5000 m高空低压低氧预处理4 h/d连续4 d后暴露10 Gz加速度组，10 Gz组为直接暴露10 Gz加速度组，各组按上述处理后，取大鼠心肌组织，委托北京华英生物技术研究室检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、热休克蛋白-70（HSP-70）以及一氧化氮（NO）、亚硝酸盐（NO2-）、硝酸盐（NO3-）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、神经型一氧化氮合酶（nNOS）的变化。结果 SOD水平：C组[（8.242±1.562）U/mg]和HHP+10 Gz组[（7.660±1.208）U/mg]高于10 Gz组[（4.773±0.665）U/mg]，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；CAT水平：C组[（2.348±0.382）U/mg]高于HHP+10 Gz组[（1.955±0.204）U/mg]和10 Gz组[（1.749±0.165）U/mg]，HHP+10 Gz组高于10Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；GSH-PX水平：C组[（91.864±38.788）U/mg]高于10 Gz组[（47.821±8.208）U/mg]， 差异有统计学意义（P < 0.05）；GSH水平：C组[（0.748±0.182）μmol/g]和HHP+10 Gz组[（0.593±0.205）μmol/g]高于10 Gz组[（0.232±0.034）μmol/g]，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；MDA水平：各组间差异无统计学意义（P > 0.054）；HSP-70水平：C组[（1.415±0.500）ng/mg]低于HHP+10 Gz组[（2.189±0.659）ng/mg]和10 Gz组[（2.452±0.926）ng/mg]，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；NO水平：C组[（1.932±0.496）μmol/g]低于HHP+10 Gz组[（2.751±0.784）μmol/g]和10 Gz组[（3.185±0.769）μmol/g]，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；NO2-水平：C组[（1.277±0.279）μmol/g]低于HHP+10 Gz组[（1.800±0.568）μmol/g]和10 Gz组[（1.970±0.362）μmol/g]，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；NO3-水平：C组[（2.191±0.426）μmol/g]低于HHP+10Gz组[（2.898±0.500）μmol/g]和10 Gz组[（2.995±0.445）μmol/g]，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；eNOS水平：C组[（3.726±0.498）U/mg]低于HHP+10 Gz组[（5.081±0.994）U/mg]和10 Gz组[（5.937±1.423）U/mg]，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；iNOS水平：C组[（3.668±0.379）U/mg]低于HHP+10 Gz组[（4.382±0.567）U/mg]和10 Gz组[（4.986±1.318）U/mg]，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；nNOS水平：C组[（0.830±0.117）U/mg]低于HHP+10 Gz组[（1.044±0.190）U/mg]和10 Gz组[（1.226±0.300）U/mg]，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 低压低氧预处理可以降低加速度对心肌造成的氧化损伤，对心肌具有保护作用，其机制与低压低氧预处理增强了大鼠体内抗氧化酶活性，减轻氧化应激对NOS的激活从而抑制NO的大量释放有关。

[关键词] 加速度；低压低氧；大鼠；心肌损伤；抗氧化；一氧化氮

[中图分类号] R852.21[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（c）-0012-05

Protection of hypobaric hypoxia preconditioning on myocardial injuries of rats after acceleration exposured

YE Bo ZHANG Guorong▲ HUANG Junmei YIN Zhe TAO Lei

Department of Anaesthesiology, Air Force General Hospital, Beijing 100142, China

[Abstract] Objective To evaluate the effect of hypobaric hypoxia preconditioning (HHP) on myocardial cells pathological physiology changes under acceleration environment from myocardial antioxidant system and NO metabolic pathways. To explain the mechanism of myocardial tissue damage by acceleration environment, explore the protection mechanism of HHP. Methods 24 male SD rats were randomly divided into 3 groups (n=8), C group was the blank control group, HHP+10 Gz group was 5000 m altitude hypoxic preconditioning 4 h/d for 4 days then exposure to 10 Gz acceleration, 10 Gz group was directly exposed to 10 Gz acceleration. After the treatment above, SOD, CAT, GSH-PX, GSH, MDA, HSP-70 and NO, NO2-, NO3- , eNOS, iNOS, nNOS content of the cardiac muscle tissue of rats were determined by Beijing Huaying Biotechnology Research Company. Results SOD level: group C [(8.242±1.562) U/mg] was higher than group 10 Gz [(4.773±0.665) U/mg], group HHP+10 Gz [(7.660±1.208) U/mg] was higher than group 10 Gz, the differences were statistically significant (P < 0.05). CAT level: group C [(2.348±0.382) U/mg] was higher than group HHP+10 Gz [(1.955±0.204) U/mg] and group 10 Gz [(1.749±0.165) U/mg], group HHP+10 Gz was higher than group 10Gz, the differences were statistically significant (P < 0.05). GSH-PX level: group C [(91.864±38.788) U/mg] was higher than group 10 Gz [(47.821±8.208) U/mg] , the differencs was statistically significant (P < 0.05). GSH level: group C [(0.748±0.182) μmol/g] and group HHP+10 Gz [(0.593±0.205) μmol/g] were higher than group 10 Gz [(0.232±0.034) μmol/g], the differences were statistically significant (P < 0.05). MDA level: there was no statistically significant differences (P > 0.05). HSP-70 levls: group C [(1.415±0.500) ng/mg] was lower than group HHP+10 Gz [(2.189±0.659) ng/mg] and group 10 Gz [(2.452±0.926) ng/mg], the differences were statistically significant (P < 0.05). NO level: group C [(1.932±0.496) μmol/g] was lower than group HHP+10 Gz [(2.751±0.784) μmol/g] and group 10 Gz [(3.185±0.769) μmol/g], the differences were statistically significant (P < 0.05). NO2- level: group C [(1.277±0.279) μmol/g] was lower than group HHP+10 Gz [(1.800±0.568) μmol/g] and group 10 Gz [(1.970±0.362) μmol/g], the differences were statistically significant (P < 0.05). NO3- level: group C [(2.191±0.426) μmol/g] was lower than group HHP+10 Gz [(2.898±0.500) μmol/g] and group 10 Gz [(2.995±0.445) μmol/g], the differences were statistically significant (P < 0.05). eNOS level: group C [(3.726±0.498) U/mg] was lower than group HHP+10 Gz [(5.081±0.994) U/mg] and group 10 Gz [(5.937±1.423) U/mg], the differences were statistically significant (P < 0.05). iNOS level: group C [(3.668±0.379) U/mg] was lower than group HHP+10 Gz [(4.382±0.567) U/mg] and group 10 Gz [(4.986±1.318) U/mg], the differences were statistically significant (P < 0.05). nNOS level: group C [(0.830±0.117) U/mg] was lower than group HHP+10 Gz [(1.044±0.190) U/mg] and group 10 Gz [(1.226±0.300) U/mg], the differences were statistically significant (P < 0.05). Conclusion HHP can reduce oxidative damage of myocardial tissue caused by acceleration and has myocardial protective effect, the mechanism is related to enhancing the activity of antioxidant enzymes and reducing oxidative stress on the activation of NOS and then inhibiting the release of NO in rats.

[Key words] Acceleration; Hypobaric hypoxia; Rats; Myocardial injuries; Anti-oxidant; NO

重复暴露于高正加速度（+Gz）对飞行员和动物心脑血管系统的不良影响已经引起了医学工作者的关注[1-2]。现已证实，+Gz作用可引起心肌收缩性能降低，心脏泵血功能下降[3-4]。病理研究表明，除心肌出现明显的超微结构改变外，间质小血管内皮细胞出现肿胀，饮泡增多，胞质出现指状突起凸向管壁，血管腔内见较多血小板聚集、附壁[5]。重复+Gz暴露后，大鼠心肌血管内皮细胞出现明显损伤，其胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达增多，提示黏附分子诱导的炎性反应参与了高+Gz应激导致的心肌损伤[6]。此外，+Gz暴露后，血浆内皮素含量明显增加，可引起冠状动脉和周围血管的强烈收缩，导致回心血量减少，心泵功能降低[7]。

间歇性低压低氧预处理（hypobaric hypoxia preconditionin，HHP）是指预先通过间断反复短时间非致死性低压低氧应激处理后，机体组织细胞获得一种抗缺氧/缺血内源性保护，对随后长时间致死性缺血/缺氧损伤的高度耐受性处理[8]。

本研究从心肌组织抗氧化系统以及一氧化氮（NO）的代谢通路研究低压低氧预处理对加速度环境下心肌细胞病理生理的变化，解释航空加速度环境心肌组织损伤机制，探讨低压低氧预处理的保护机制，为进一步研究航空环境对人体的影响提供实验依据，为寻找合适的对抗加速度应激导致心肌损伤的防护措施打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物雄性SD大鼠24只，体重（294.71g±9.98）g，由航空航天医学研究院提供。

1.1.2 药品与试剂2.5%戊巴比妥溶液（航空航天医学研究院提供），超氧化物歧化酶（SOD）含量试剂盒、过氧化氢酶（CAT）含量试剂盒、谷胱甘肽（GSH）含量试剂盒、丙二醛（MDA）含量试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）含量试剂盒、热休克蛋白-70（HSP-70）含量试剂盒、一氧化氮（NO）含量试剂盒、亚硝酸盐（NO2-）含量试剂盒、硝酸盐（NO3-）含量试剂盒、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）含量试剂盒、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）含量试剂盒、神经型一氧化氮合酶（nNOS）含量试剂盒，以上试剂盒均由南京建成公司提供。

1.1.3 仪器与设备低压低氧舱（航空航天医学研究院），动物离心机（航空航天医学研究院），BCM-130D超净台（苏净集团安泰公司），手术器械（空军总医院手术室提供），标本袋（空军总医院手术室提供）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组将雄性SD大鼠领回后，先饲养1周并使其适应实验环境，排除惊吓、环境等因素对大鼠的影响。随机分为3组，每组8只，C组：空白对照组；HHP+10 Gz组：低压低氧预处理后暴露10 Gz加速度组；10 Gz组：单纯暴露10 Gz加速度组。

1.2.2 低压低氧预处理方案参照刘杰等[9]的低压低氧方案，将HHP+10 Gz组大鼠置于低压氧舱接受4 d相当于5000 m高空的低压低氧处理，每天4 h。

1.2.3 加速度暴露方案将HHP+10 Gz组及10 Gz组大鼠置于动物离心机中，每次两只进行加速度暴露。动物离心机的半径为2 m，可模拟的正加速度范围为+1～+12 Gz ，由计算机进行加速度程序控制。将大鼠水平固定于离心机的转臂上，头部朝向离心机旋转轴心，具体方案为水平加速度+10 Gz，峰值作用时间为5 min ，加速度增长率为1 GPs。加速度暴露结束后立即进行相应检测。

1.2.4 生化指标检测采用2.5%戊巴比妥溶液，按照每100 g体重0.5 mL腹腔注射对大鼠进行麻醉，麻醉起效后，断头处死大鼠，取心肌组织。标本委托北京华英生物技术研究室采用比色法进行SOD、CAT、GSH-PX、GSH、MDA、HSP-70、NO、NO2-、NO3-、eNOS、iNOS、nNOS含量的测定。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织抗氧化系统指标比较

实验结果显示，SOD水平：C组与HHP+10 Gz组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），C组与HHP+10 Gz组均高于10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；CAT水平：C组高于HHP+10 Gz组和10 Gz组，HHP+10 Gz组高于10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；GSH-PX水平：C组与HHP+10 Gz组、HHP+10 Gz组与10 Gz组比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05），C组高于10 Gz组，差异有统计学意义（P < 0.05）；GSH水平：C组与HHP+10 Gz组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），C组与HHP+10 Gz组均高于10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）；MDA水平：各组间比较差异均无统计学意义（均P > 0.05）；HSP-70水平：C组低于HHP+10 Gz组和10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05），HHP+10 Gz组与10 Gz组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠心肌组织一氧化氮代谢通路指标比较

实验结果显示，NO水平：C组低于HHP+10 Gz组和10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05），HHP+10 Gz组与10 Gz组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；NO2-水平：C组低于HHP+10 Gz组和10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05），HHP+10 Gz组与10 Gz组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；NO3-水平：C组低于HHP+10 Gz组和10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05），HHP+10 Gz组与10 Gz组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；eNOS水平：C组低于HHP+10 Gz组和10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05），HHP+10 Gz组与10 Gz组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；iNOS水平：C组低于HHP+10 Gz组和10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05），HHP+10 Gz组与10 Gz组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；nNOS水平：C组低于HHP+10 Gz组和10 Gz组，差异均有统计学意义（均P < 0.05），HHP+10 Gz组与10 Gz组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

3 讨论

CAT、GSH-PX、SOD等抗氧化酶构成人体重要的抗氧化酶系统，相互协同以减少活性氧族的产生，防止脂质过氧化及其中间产物对机体的损害。SOD是体内唯一清除过氧化物的酶，通过它的作用将过氧化物变成H2O2，当人体产生的H2O2超过机体的清除能力在体内蓄积时，其活性下降[10]。CAT是一类以铁卟啉为辅基的结合酶，具有较强的自由基清除功能，对组织的氧化损伤有防护作用[11]。过氧化氢在过氧化氢酶的作用下转化为水和分子氧[12]，阻止H2O2在铁螯合剂存在的条件下与O2-反应生成更有害的OH-[13]。CAT在灭活H2O2的同时消耗增加，从而造成其活性下降。MDA为脂质过氧化终产物，测试MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度[14-16]。GSH-PX主要清除脂类氢过氧化物（ROOH），并协同CAT清除H2O2，抑制ROS生成。GSH-PX以硒氢基（-SeH）的形式发挥作用，与GSH反应分解体内的H2O2和脂质过氧化物，分别生成相应的水和醇化物，从而使细胞膜和其他生物组织免受过氧化损伤，当CAT含量显著减少时，GSH-PX可代替CAT催化H2O2分解。本研究显示，10 Gz组较HHP+10 Gz组SOD、CAT、GSH-PX、GSH水平降低，MDA水平增加，可见，低压低氧预处理后，增强了心肌组织的抗氧化能力，使加速度对心肌组织造成的氧化应激损伤程度减小，对心肌有保护作用。

HSP-70是HSP家族中最保守和最主要的一类，具有广泛的生物学功能，包括分子伴侣功能、免疫功能、抗氧化功能、抗细胞凋亡功能、提高细胞的应激耐受性功能等功能，缺血/缺氧应激早期，高浓度的HSP-70有效地聚集在神经元染色体和核质内，是其能耐受缺氧缺血性损伤的一个重要标志[17]。本实验结果显示，HHP+10 Gz组较10 Gz组HSP-70水平明显增高，可见低压低氧激活了大鼠体内HSP-70的活性，增强了心肌的抗氧化能力。

NO作为一种相对稳定的气体自由基，对人体有双重的生物学作用。一方面其可以调节人体正常的生理功能，如血液循环、信息传递、能量代谢及免疫调节等；另一方面，体内NO合成量过多或过少均会造成对机体的危害，如低血压休克、细胞损伤或高血压、动脉粥样硬化和缺血等[18-19]。NO产生的经典途径依赖于一氧化氮合酶（NOS）的活性，NOS可分为3类，即主要存在于内皮细胞中的eNOS、存在于神经细胞中的nNOS以及存在于巨噬细胞、胶质细胞中的iNOS。NOS可逐步氧化L-精氨酸为L-胍氨酸，从而产生NO。产生的NO可与多种分子，如蛋白质、核酸、脂类、碳水化合物和其他自由基发生反应，也可迅速氧化为亚硝酸及硝酸[20]。此外有针对内皮细胞的研究报道，小剂量H2O2可使eNOS发生磷酸化而使其活性增强，进而催化L-精氨酸产生大量NO[21]。本实验数据显示，HHP+10 Gz组及10 Gz组NO含量均高于C组，且eNOS、iNOS及nNOS含量增加，NO2-和NO3-水平升高，可见加速度产生的应激反应使NOS活性增加，催化L-精氨酸产生大量NO，NO又迅速氧化为NO2-和NO3-。HHP+10 Gz组数据较10Gz组降低，可见低压低氧预处理后暴露加速度降低了加速度对心肌的氧化损伤，使NO释放量减少，对心肌有保护作用，但本实验HHP+10 Gz组及10 Gz组数据统计学差异不显著，可通过扩大样本量进一步证实。

综上所述，可以得出结论：低压低氧预处理可以降低加速度对心肌造成的氧化损伤，对心肌具有保护作用，其机制与低压低氧预处理增强了大鼠体内抗氧化酶活性，减轻氧化应激对NOS的激活从而抑制NO的大量释放有关。

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（收稿日期：2014-03-12本文编辑：程铭）

HSP-70是HSP家族中最保守和最主要的一类，具有广泛的生物学功能，包括分子伴侣功能、免疫功能、抗氧化功能、抗细胞凋亡功能、提高细胞的应激耐受性功能等功能，缺血/缺氧应激早期，高浓度的HSP-70有效地聚集在神经元染色体和核质内，是其能耐受缺氧缺血性损伤的一个重要标志[17]。本实验结果显示，HHP+10 Gz组较10 Gz组HSP-70水平明显增高，可见低压低氧激活了大鼠体内HSP-70的活性，增强了心肌的抗氧化能力。

NO作为一种相对稳定的气体自由基，对人体有双重的生物学作用。一方面其可以调节人体正常的生理功能，如血液循环、信息传递、能量代谢及免疫调节等；另一方面，体内NO合成量过多或过少均会造成对机体的危害，如低血压休克、细胞损伤或高血压、动脉粥样硬化和缺血等[18-19]。NO产生的经典途径依赖于一氧化氮合酶（NOS）的活性，NOS可分为3类，即主要存在于内皮细胞中的eNOS、存在于神经细胞中的nNOS以及存在于巨噬细胞、胶质细胞中的iNOS。NOS可逐步氧化L-精氨酸为L-胍氨酸，从而产生NO。产生的NO可与多种分子，如蛋白质、核酸、脂类、碳水化合物和其他自由基发生反应，也可迅速氧化为亚硝酸及硝酸[20]。此外有针对内皮细胞的研究报道，小剂量H2O2可使eNOS发生磷酸化而使其活性增强，进而催化L-精氨酸产生大量NO[21]。本实验数据显示，HHP+10 Gz组及10 Gz组NO含量均高于C组，且eNOS、iNOS及nNOS含量增加，NO2-和NO3-水平升高，可见加速度产生的应激反应使NOS活性增加，催化L-精氨酸产生大量NO，NO又迅速氧化为NO2-和NO3-。HHP+10 Gz组数据较10Gz组降低，可见低压低氧预处理后暴露加速度降低了加速度对心肌的氧化损伤，使NO释放量减少，对心肌有保护作用，但本实验HHP+10 Gz组及10 Gz组数据统计学差异不显著，可通过扩大样本量进一步证实。

综上所述，可以得出结论：低压低氧预处理可以降低加速度对心肌造成的氧化损伤，对心肌具有保护作用，其机制与低压低氧预处理增强了大鼠体内抗氧化酶活性，减轻氧化应激对NOS的激活从而抑制NO的大量释放有关。

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（收稿日期：2014-03-12本文编辑：程铭）

HSP-70是HSP家族中最保守和最主要的一类，具有广泛的生物学功能，包括分子伴侣功能、免疫功能、抗氧化功能、抗细胞凋亡功能、提高细胞的应激耐受性功能等功能，缺血/缺氧应激早期，高浓度的HSP-70有效地聚集在神经元染色体和核质内，是其能耐受缺氧缺血性损伤的一个重要标志[17]。本实验结果显示，HHP+10 Gz组较10 Gz组HSP-70水平明显增高，可见低压低氧激活了大鼠体内HSP-70的活性，增强了心肌的抗氧化能力。

NO作为一种相对稳定的气体自由基，对人体有双重的生物学作用。一方面其可以调节人体正常的生理功能，如血液循环、信息传递、能量代谢及免疫调节等；另一方面，体内NO合成量过多或过少均会造成对机体的危害，如低血压休克、细胞损伤或高血压、动脉粥样硬化和缺血等[18-19]。NO产生的经典途径依赖于一氧化氮合酶（NOS）的活性，NOS可分为3类，即主要存在于内皮细胞中的eNOS、存在于神经细胞中的nNOS以及存在于巨噬细胞、胶质细胞中的iNOS。NOS可逐步氧化L-精氨酸为L-胍氨酸，从而产生NO。产生的NO可与多种分子，如蛋白质、核酸、脂类、碳水化合物和其他自由基发生反应，也可迅速氧化为亚硝酸及硝酸[20]。此外有针对内皮细胞的研究报道，小剂量H2O2可使eNOS发生磷酸化而使其活性增强，进而催化L-精氨酸产生大量NO[21]。本实验数据显示，HHP+10 Gz组及10 Gz组NO含量均高于C组，且eNOS、iNOS及nNOS含量增加，NO2-和NO3-水平升高，可见加速度产生的应激反应使NOS活性增加，催化L-精氨酸产生大量NO，NO又迅速氧化为NO2-和NO3-。HHP+10 Gz组数据较10Gz组降低，可见低压低氧预处理后暴露加速度降低了加速度对心肌的氧化损伤，使NO释放量减少，对心肌有保护作用，但本实验HHP+10 Gz组及10 Gz组数据统计学差异不显著，可通过扩大样本量进一步证实。

综上所述，可以得出结论：低压低氧预处理可以降低加速度对心肌造成的氧化损伤，对心肌具有保护作用，其机制与低压低氧预处理增强了大鼠体内抗氧化酶活性，减轻氧化应激对NOS的激活从而抑制NO的大量释放有关。

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