克雷伯氏菌在农业与环境治理上的应用

李梦娇, 彭 晟, 徐绍忠, 余代宏, 赵明富*, 文国松*

1.云南农业大学植物保护学院, 昆明 650021;

2.云南农业大学云南省中药材规范化种植技术指导中心, 昆明 650021;

3.元江县农科所, 云南 玉溪 653300

克雷伯氏菌属(Klebsiellaspp.)的一些种类是重要的条件致病菌和医源性感染菌，其中以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)对人致病性最强，但在农业微生物和工业污染治理等方面的研究表明，克雷伯氏菌对植物本身不表现致病性，而且还是一种绿色菌肥和高效净化剂。克雷伯氏菌普遍分布于禾本科植株的根部以及土壤中，是一种丰富的根系联合固氮微生物资源，与植物在长期进化和系统发育过程中建立起紧密的合作关系，对植物的生长及代谢起着间接的促进作用。关于克雷伯菌的研究已有很多报道，研究主要涉及克雷伯氏菌菌株促进土壤营养物质转化、降解苯类有机物、作为铁载体等方面。本文将克雷伯氏菌主要种类的特性以及在农业和环境治理的应用研究进展作一概述。

1 克雷伯氏菌的主要种类及特性

克雷伯氏菌属菌体形态为杆状，大小约(0.3～1.0)μm×(0.6～6.0)μm。单个、成对或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有荚膜，革兰氏染色反应为阴性，氧化酶阴性。兼性厌氧型，对营养要求不高，不需要特殊的生长因子。在固体培养基上可形成特征性的粘液状菌落，表现为接种环不易挑起，易拉成丝，有助鉴别。在肠道杆菌选择性培养基上能发酵乳糖，呈现有色菌落。发酵糖类活泼，并且产酸产气。该属细菌55℃下30 min可被灭活。在固体培养基上可存活数周至数月。克雷伯氏菌属包括肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、解鸟氨酸克雷伯氏菌(Klebsiellaornithinolytica)、土生克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)、植生克雷伯氏菌(Klebsiellaplanticola)、臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiellaozaenae)、臭硬结克雷伯氏菌(Klebsiellarhinoscleromatis)和变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)。臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiellaozaenae)、臭硬结克雷伯氏菌(Klebsiellarhinoscleromatis)也作为肺炎克雷伯氏菌的亚种，称为肺炎克雷伯菌臭鼻克雷伯氏菌和鼻硬结克雷伯氏菌亚种。在以上克雷伯氏菌中，与农业生产密切相关的有肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌以及最近几年报道的变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)。各菌主要生理生化特征见表1。

表1 克雷伯氏菌菌各菌种生理生化特征

2 克雷伯氏菌在农业上的应用

克雷伯氏菌在农业上的应用比较广泛，主要有固氮、作物增产、增强植物溶磷能力、促生长等作用，并且产生相关作用的菌株可发酵成绿色菌肥用于实际生产。

2.1克雷伯氏菌的固氮作用

克雷伯氏菌具有固氮功能，对植物有促生长作用。李凤汀等[1]利用15N稀释法研究小麦接种肺炎克雷伯氏菌(K.pneuniae)的联合固氮作用。结果表明，小麦根系存在固氮有机体，直接为植株提供的氮素占其总氮量的l5.3％～22.1％，干物质重和15N含量与对照相比差异显著。李树品等[2]和黄磊等[3]从小麦根系分离得到固氮酶活性较高的TB-3、CXK192和CXK193菌株，经鉴定均属克雷伯氏菌。韩梅等[4]从玉米东单90和郑单958健康鲜植株中均分离到克雷伯氏菌(Klebsiellatrevisan)，利用乙炔还原法测定出固氮酶活性，通过对玉米的促生长作用作进一步研究，结果表明该菌为内生固氮菌，对幼苗期玉米具有显著的促生长作用。罗霆等[5]采用无氮Dobereiner培养基，从甘蔗品种桂糖28号的根系中分离筛选到1株高固氮活性的细菌菌株L03，形态、生理生化、16S rDNA序列系统发育分析鉴定L03为植生克雷伯氏菌(K.plantien)，该菌固氮百分率达29％，并在连续继代培养13次后仍保持固氮能力不变。李树品等[2]将产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)菌悬液与草炭土按一定比例充分混匀，在砂培试验中，用于小麦种子拌种，结果拌菌剂的小麦生长速度快，略有提早出苗，植株较健壮并且干重增加，从而显示该菌剂对小麦具有明显的促生效果。而李凤汀等[1]将肺炎克雷伯氏菌接种到小麦植株上，同样获得了小麦增产的效果，即小麦总茎数、绿色叶片数与对照相比明显增加，干物质累积也增多，测定的固氮酶活性也比对照高十几倍。

从克雷伯氏菌属细菌中克隆到固氮基因nif已有报道[6～9]，证实了克雷伯氏菌属细菌具有固氮作用的遗传基础，并且在禾本科植物的联合固氮上发挥重要作用。在肺炎克雷伯氏菌(K.peneumoniae)中存在着17～18个nif基因，这些基因都位于其染色体上，其中有固氮酶结构基因nifKDH、调节基因nifAL和固氮酶合成后的加工基因nifB以及其他与电子传递相关的基因。所有nif基因均连锁在一起，其中不存在非nif基因的插入成分；在nif基因群中存在着7个操纵子，其中有6个操纵子具有向同一方向进行转录的功能；在nifF基因和nifH基因之间还存在着一段反向阅读框架。

2.2克雷伯氏菌的溶磷、解钾作用

土生克雷伯氏菌(K.pneumonia)能够提高植株的生物量与植物体的含磷量，并且该菌能顺利入侵禾本科植物的根内并成功定殖[10]。微生物解磷作用依赖于微生物分泌有机酸的能力，这些酸既能降低pH，又能够与钙、铁、铝等离子结合，从而使难溶性磷酸盐溶解成可溶性盐，易于植物吸收[11,12]。

王小妹等[13]采用固、液体无机磷培养基研究从土壤中分离得到土生克雷伯氏杆菌102菌株(K.pneumoniae102)，在液体纯培养条件下，该菌在无可溶性磷存在时其溶解磷矿粉的量高达72.83 mg/L；在含有10 mg/L、20 mg/L 磷酸二氢钾时，该菌溶解磷矿粉的量分别为61.92 mg/L、66.36 mg/L。叶小梅[10]进而采用室内盆栽方法，研究了菌株102在两种土壤中对黑麦草生长、 磷吸收以及土壤有效磷的影响，同时采用抗生素与GFP双标记法观察其在黑麦草根内定殖情况。研究发现，接种102菌25 d后，马肝土与潮土中的有效磷含量分别增加9.7％和42.1％，差异达到显著水平。 接种102菌还显著提高了黑麦草生物量与植物体磷含量，示踪结果表明102菌能够入侵黑麦草根内并定殖。通过调控克雷伯氏菌的营养和其他环境条件，还可使产酸克雷伯氏菌产生较多的IAA为植物提供更多的外源促生长物质，促进植物的生长发育，特别是根系的生长[14]。

此外，张成省等[15]利用选择性培养基从烟草根际筛选到27株解钾细菌，测定解钾细菌的解钾效能并研究其对烟草的促生作用。27株菌株的16S rDNA序列分析结果表明，这些烟草根际土壤解钾细菌中克雷伯菌属(Klebsiellaspp.)为优势菌属，占66.67％。

2.3克雷伯氏菌的生物防治作用

随着对人类健康和环境问题的关注，根际细菌次生代谢产物的应用将为促进植物生长、防御植物病原菌提供新途径。Park等[16]研究发现，产酸克雷伯菌(K.oxytoca)可引起系统诱导抗性(induced systemic resistance，ISR)主动防御软腐病原菌胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种[Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorumSCCI(SCC1)]，其代谢物在12 mmol/L时对SCC1引起的症状有显著抑制作用。将分离得到的代谢物经高分辨率质谱分析表明其为C9H15O3N有机物，分子量大小为185.11。基于核磁共振谱分析，分离得到的代谢物被鉴定为2-吡咯烷酮-5-羧酸丁酯(BPC)。

关于克雷伯氏菌作为生防菌应用目前报道较少。李祖红等[17]从石斛上分离到一株内生细菌SH-1(Klebsiellavariicola)，用该细菌制剂防治由链格孢引起的烟草赤星病、甘蓝黑斑病及番茄早疫病有显著的防治效果，且该菌具有对人、畜、农作物安全和环境友好的特点。另一方面，利用基因工程改造的内生细菌来防治植物病虫害已显示出一定的应用前景，如夏启玉等[18]获得香蕉内生克雷伯氏菌KKWB-5的强启动子片段，来达成香蕉内生工程菌的构建，从而达到既可提高植物的抗病虫能力，又不会改变植物自身基因，所以该方法与转基因植物的方法相比具有更多的优势。

2.4克雷伯氏菌作为铁载体的应用

植物根围促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)具有固氮功能，且可产生和分泌嗜铁素及各种对铁具有高亲和力的载体，合成生长素、乙烯、细胞分裂素和维生素等不同植物激素，溶解矿物质等[19～21]。何苗等[22，23]通过铬天青(chrome azural S，CAS)检测法筛选出一株产铁载体能力较强的细菌菌株MX-26(K.oxytoca)，并证实该菌能够分泌铁载体到其细胞外或细胞表面，作为螯合因子来结合Fe3+或者将含铁化合物变为可溶形式以便其利用。对其进行紫外诱变(180 S)、紫外和氯化锂(终浓度1.2％)复合诱变及紫外和硫酸二乙酯(DES)复合诱变(40 min)，诱变获得的菌株的产铁载体能力较出发菌株提高了32.9％，且遗传性能较稳定，并能成功定殖在土壤中，这对防治石灰性土壤上植物的缺铁黄化有重要意义。该研究还发现，进行单一紫外诱变获得的诱变菌株很容易失去诱变获得的性能，而紫外和氯化锂或者硫酸二乙酯复合诱变所获得的突变株其遗传稳定性明确高于单纯的紫外诱变，其中，作为诱变辅助剂的氯化锂和硫酸二乙酯起到了非常重要的作用。

3 克雷伯氏菌在环境污染物降解方面的研究

克雷伯氏菌比厌氧菌生长更快，通常能把复杂有机化合物降解为无机物，能比较有效地降低化合物的毒性[24]，从而在降解农药残留和环境污染治理方面也具有一定的应用前景。

氯氰菊酯是茶叶生产上使用比较广泛的高效杀虫剂，其自然条件下很难快速降解, 并且长期使用会导致茶叶的农药残留超标和环境污染[25，26]。米兰等[27]从茶园土壤中分离到1株产酸克雷伯氏菌, 研究证实该菌株对氯氰菊酯的耐受性、降解性及稳定性均较好。因此，可挖掘克雷伯氏菌的农药降解酶基因，构建工程菌株。王卓娅等[28]通过构建基因文库的方式，使一株克雷伯氏菌(Klebsiellaspp.)获得了新的菊酯农药降解酶(EstP)基因，并借助生物信息学技术优化该基因的表达，以构建降解能力更强的工程菌。

克雷伯氏菌在处理工业废水方面的研究也很多，如已经证实从含氰废水中分离出来的克雷伯氏菌通过生物降解能将氰化物转变无毒的产物[29]，对采用生物处理含氰废水具有着较大的研究意义。王强等[24]在活性污泥中分离出一株产酸克雷伯氏菌，研究发现该菌株具有降解苯酚的能力。边侠玲等[30]在试验中发现KlebsiellaZY-B能以双酚A为唯一碳源生长，适宜的发酵温度为30～35℃，在中性介质中表现出较强的降解能力，具有较大的工业应用价值。赵迪[31]从硝基苯污水处理池中筛选分离得到一株能利用硝基苯为唯一碳源且将其高效降解的菌株，命名为NB-K，16S rDNA序列分析显示其与Klebsiellavariicola的16S rDNA序列相似度达99％。在治理工业废气污染方面，赵翠翠等[32]对克雷伯氏菌ME17菌株进行了优化条件和初始培养条件的比较，在pH 6.0，24.4℃的培养条件下，采用接种量6.7％，ME17对25％CH4的脱除能力较高，因而该菌株具有治理煤矿和垃圾填埋释放CH4的应用潜力。

克雷伯氏菌对环境污染物的降解机制研究有助于提高降解酶的降解能力。叶锦韶等[33]研究肺炎克雷伯氏菌对三苯基锡(TPhT)的酶促降解特性时发现，肺炎克雷伯氏菌的胞内降解酶对TPhT的降解率最高，并且pH、温度、TPhT浓度和金属离子等环境因素均会对胞内酶降解TPhT的效果产生影响，其中Mg2+的作用最明显，能有效地提高TPhT酶促降解的效果，当Mg2+的添加浓度为15 mg/L 时，胞内酶对TPhT的降解率高达73.8％。

4 展望

克雷伯氏菌属细菌具有明显的高效固氮、促生长作用、对植物病害的生防作用以及环境污染物降解作用，属有益菌。更好地挖掘该菌属的生物功能并加以利用还需要在以下方面进行探讨。

在植物营养物质转化研究方面，尽管有研究证明肺炎克雷伯氏菌能够提高植物的固氮水平，但由于其致病性，并不宜作为菌剂使用，其研究应更倾向于固氮机理的研究，为工程菌剂的开发提供基础。在大田生产中，大量的施用氮肥可能是使固氮菌失活的最主要原因[5]，因此高固氮农作物品种选育应与增加大田或作物体内的固氮菌种类和数量结合起来，并在此基础上发挥其固氮特性。但筛选出适合本地区栽培品种的高效内生固氮菌有一定的难度，因为内生固氮菌对作物的内外部环境的适应性是特异的，不同的作物品种、温湿度和光强会影响其与宿主的联合固氮能力[34]，所以需在大田中做大量的接种或回接实验，以确定某种固氮菌是否适合当地大田的联合固氮。王小妹等[13]利用溶磷菌提高土壤磷利用效率，研究发现解磷菌的溶磷作用只是在中、低肥力土壤上进行，对高肥力的土壤而言磷的利用率并没有得到提高；溶磷菌入侵植株体内的能力是否对土壤溶磷有帮助，还有待深入研究[10]。关于内生工程菌的构建，虽然已构建出内生克雷伯氏菌的工程菌[18]，但该类菌在农作物或水果作物上的定殖还没有报道，可以对工程菌的定殖能力、生防特性的遗传稳定性等方面进行研究。

在农药残留降解方面，克雷伯氏菌也是一种潜力巨大的生态菌，如对菊酯类农药的降解。深入了解菊酯降解酶的作用机制，构建高效工程菌有助于开发菊酯农药残留降解制剂，在突破绿色壁垒、保护生态环境及维护人类生存环境安全等方面具有很大的应用价值。

充分发挥克雷伯氏菌在农业发展、环境治理、工业生产等方面的应用潜力，还需要进一步开展该菌作用机理方面的研究，深入解析其作用的分子机制，并对其代谢调控网络进行系统性研究，同时，加强与植物栽培育种、植物生理以及生态环境等学科的交叉研究。

[1]李凤汀，刘荣昌，郝正然，等. 利用15N释法研究小麦接种肺炎克雷伯氏菌联合固氮作用[J].微生物学报，1989，28(3)：200-203.

[2]李树品，蒋千里，楚 杰，等.产酸克雷伯氏杆菌(klebsiellaoxytoca)的分离及其特性研究[J].山东科学，1991，4(3)：19-26.

[3]黄 磊，石万瑜，董绍佩.小麦根系克雷伯氏杆菌的分离与鉴定[J].新疆农业科学，1990，(1)：27-28.

[4]韩 梅，罗培宇，肖亦农，等.玉米内生固氮菌的分离鉴定及其促生长作用研究[J].沈阳农业大学学报，41(1)：94-97.

[5]罗 霆，欧阳雪庆，杨丽涛，等.1株有固氮能力的甘蔗克雷伯氏菌的分离鉴定及固氮特性[J].热带作物学报，2010，31(6)：972-978.

[6]Dixon R，Eady R R,Espin G，etal.. Analysis of regulation ofKlebsiellapneumoniaenitrogen fixation (nif) gene cluster with gene fusions[J]. Nature，1980，286(5769)：128-132.

[7]Buchanan-Wollaston V，Cannon M C，Beynon J L，etal.. Role of the n gene product in the regulation ofnifexpression inKlebsiellapneumonia[J]. Nature，1981，294(5843)：776-778.

[8]Merrick M，Filser M，Dixon R，etal.. The use of translocatable genetic elements to construct a fine-structure map of theKlebsiellapneumoniaenitrogen fixation gene cluster[J]. J. Gen. Microbiol.，1980，117(2)：509-520.

[9]Kennedy C. Linkage map of the nitrogen fixation genes inKlebsiellapneumoniae[J]. Mol. Gen. Genet.，1977，157(2)：199-204.

[10]叶小梅，何家骏，王小妹.一株土生克雷伯氏菌接种对黑麦草生长及磷吸收的影响[J].江苏农业科学，2008，(2)：164-166.

[11]杨秋忠，张芝贤，陈立夫，等. 台湾土生固氮溶铁磷细菌特性之研究[J]中国农业化学会志，1998，36(2)：201-210.

[12]赵小蓉，林启美，李保国. 溶磷菌对4种难溶性磷酸盐溶解能力的初步研究[J]. 微生物学报，2002，42(2)：236-242.

[13]王小妹，袁 生，常志州，等.一株土生克雷伯氏杆菌溶磷能力的初步研究[J].土壤通报，2006，37(4)：753-756.

[14]吕泽勋，宋 夫.培养条件对产酸克雷伯氏菌SG-11生物合成IAA影响的研究[J]. 应用与环境生物学报，2000，6(1)：66-69.

[15]张成省，陈 雪，张玉芹，等.烟草根际土壤中解钾细菌的分离与多样性分析[J].中国生态农业学报，2013，21(6)：737-743.

[16]Park M R， Kim Y C，Lee S，etal.. Identification of an ISR-related metabolite produced by rhizobacteriumKlebsiellaoxytocaC1036 active against soft-rot disease pathogen in tobacco[J]. Pest Manag. Sci.，2009，65(10)：1114-1117.

[17]李祖红，曾 嵘，文国松，等.一株植物内生细菌SH-1及其应用[P].中华人民共和国专利， CN 103484399A.

[18]夏启玉，孙建波，顾文亮，等.香蕉内生克雷伯氏菌KKWB-5强启动子片段的分离及鉴定[J].中国生物工程杂志，2011，31(4)：37-43.

[19]Vessey J K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofer-tilizers[J]. Plant Soil，2003，255：571-586.

[20]Yang J，Kloepper J W，Ryu C M. Rhizosphere bacteria help plants tolerate abiotic stress[J]. Trends Plant Sci.，2009，14(1)：1-4.

[21]Ryu C M， Murphy J F， Mysore K S，etal.. Plant growth-promoting rhizobacteria systemically protectArabidopsisthalianaagainst Cucumber mosaic virus by a salicylic acid and NPR1-independent and jasmonic acid-dependent signaling pathway [J]. Plant J. ，2004，39(3)：381-392.

[22]何 苗，黄 云，王 靖，等.桃树根际铁载体产生茵MX-26的分离鉴定及诱变选育[J].植物保护学报，2011，38(5)：432-436.

[23]何 苗. 铁载体细菌对桃树缺铁黄化病的生物防治初步研究[D].成都：四川农业大学，硕士学位论文，2011.

[24]王 强，马沛生，王加宁，等.一株苯酚降解产酸克雷伯菌的分离与鉴定[J].中山大学学报，2007，46 (6)：57-58.

[25]王兆守，尤民生，李秀仙，等.茶叶上拟除虫菊酯类农药降解菌的分离及其特性[J].生态学报，2005，25(7)：1824-1827.

[26]王玉莲，武秀利.市售茶叶卫生质量现状及分析[J].中国卫生检验杂志，2005， 15(4)：469-470.

[27]米 兰，刘书亮，杨 芳，等.茶园土壤中可高效降解氯氰菊酯微生物的筛选及其降解特性研究[J].食品科技，2009，34(4)：2-5.

[28]王卓娅，刘玉焕，李 荷，等.克雷伯氏茵ZDll2氯氰菊酯降解酶基因的克隆与生物信息学分析[J]. 广东药学院学报，2008，24(3)：277-281.

[29]范亚锋(译). 对克雷伯茵采用固定化细胞技术处理含氰废水[J].黄金，2010，31(2)：59.

[30]边侠玲，于 莹，姚日生，等.克雷伯氏菌ZY-B降解双酚A的降解条件优化研究[J].合肥工业大学学报，2010，33(9)：1382-1386.

[31]赵 迪.高效硝基苯降解菌的分离及降解特性研究[D].郑州：河南农业大学，硕士学位论文，2013.

[32]赵翠翠，郑 军，赵艮贵，等.甲烷利用克雷伯氏菌ME17菌株培养参数优化研究[J].山西大学学报，2010，33(3)：453-457.

[33]叶锦韶，史一枝，尹 华，等.克雷伯氏菌对三苯基锡的酶促降解特性[J].环境科学，2010， 31(2)：459-454.

[34]田 颖，陈 萍. 联合固氮菌研究进展[J]. 安徽农业科学，2005，33(11)：2131-2133.