肌肉生长抑制素基因在哺乳动物中的最新研究进展

高 丽, 谌 颜, 扈廷茂, 李光鹏

内蒙古大学生殖生物学与生物技术教育部重点实验室, 呼和浩特 010021

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)，也称为生长分化因子8(growth differentiation factor 8，GDF8)，是转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员。TGF-β超家族成员在维持组织稳态和对胚胎发育、骨骼肌生长发育方面发挥着重要的调控作用。在研究比利时兰牛和皮埃蒙特牛时发现，这两种牛的一些个体，其臀部、上臂、大腿、胸以及起支撑作用的肌肉群非常发达，人们把这种现象称之为双肌臀现象，并发现这种现象与MSTN基因有关。本文对MSTN基因在哺乳动物中的最新研究进展进行了综述，重点阐述和讨论了MSTN通路与其他通路之间的相互关系，及试验条件下MSTN对肌肉发育相关基因的作用等。

1 肌肉生长抑制素的功能

在研究具有双肌臀现象的比利时蓝牛和皮尔蒙特牛时，发现比利时蓝牛的MSTN基因第3外显子缺失了11 bp(937～947)，这一突变使得自缺失区段后面的第14 个密码子开始的翻译功能被破坏，因此C末端只有7个氨基酸可以翻译，其余的102个氨基酸(274～375)都将丢失，从而导致了蛋白质功能的缺失[1]。在皮尔蒙特双肌臀牛中，检测出2个点突变，其中一个突变是第3号外显子的1 056 G→A突变，导致该基因所编码的氨基酸由半胱氨酸突变成为酪氨酸，结果肌肉生长抑制素的功能几乎全部丧失；通过Southern杂交分析表明，该双肌牛在这个位点是纯合的。另一个突变的外显子(C→A)，导致编码的亮氨酸突变成为苯丙氨酸。在MSTN无义动物中，骨骼肌显著增加，与野生型相比其脂肪含量显著下降[1]。在自然突变的牛、羊、狗和人以及抑制这个蛋白功能的成体鼠中都观察到了相似的现象，而过表达MSTN会导致肌肉量的减少。Taylor等[2]研究发现，重组MSTN 可以阻碍细胞增生，也会抑制相关蛋白质的合成，从而导致肌肉不发达。Ríos等[3]将MSTN蛋白加入培养基时发现，对C2C12成肌细胞的抑制作用与所加蛋白浓度的增加成正比；用小鼠MSTN 的cDNA 重组体瞬时转染C2C12成肌细胞，可以有效地抑制细胞增殖。这些研究结果都表明MSTN对于骨骼肌生长是一个负调控因子。

在胚胎发育阶段，MSTN只在骨骼肌中表达，控制成肌细胞分化和增殖。但在成年期，它不仅在骨骼肌中表达，也在其他组织中表达(例如心脏、脂肪和乳腺组织)。在健康心脏中MSTN的表达是很低的，而且大多是在浦肯野氏纤维中表达，而在心肌细胞中没有检测到[4,5]。在发生心肌梗塞的羊中发现MSTN表达有提高，但其表达只局限在损伤的区域。George等[4]报道了在衰竭的心脏中MSTN表达水平增加，这一结果与Heineke等[5]的研究结果一致，证明通过心肌细胞产生的MSTN可以刺激心脏的肌肉萎缩。这些研究表明MSTN对于心肌细胞也是一个负调控因子，但是其具体机制与骨骼肌中是否一致还有待进一步的研究。

2 肌肉生长抑制素基因的结构特点

MSTN是一种分泌型多肽，MSTN cDNA由一个开放阅读框(opening reading frame，ORF)和可以编码376个氨基酸的核苷酸序列组成，含有3个外显子和2个内含子。未经过剪切加工的全长蛋白为52 kDa，具有TGF-β超家族共有的分子结构，即由信号肽、编码前肽(26 kDa)的N-末端区和编码成熟肽(12.5 kDa)的 C-末端区三部分组成52 kDa的前体蛋白，在N-末端区和C-末端区之间有一个蛋白酶解加工位点。52 kDa的前肽经过蛋白酶切加工后，会释放出26 kDa的活性肽，这种加工后的成熟肽与特异性受体结合从而发挥生物学效应[6]。

哺乳动物的MSTN在结构上高度保守，羊、猪、马和人等不同物种的MSTN基因的编码区高度保守，牛和绵羊仅有1～3个碱基的差别。对牛的肌肉生长抑制素基因全序列分析显示，该基因包含3个外显子和2个内含子。第1和第2个外显子的长度分别为506 bp和374 bp。第3个外显子的长度随着poly(A)尾巴位点的不同而有所不同(1 701 bp、1 812 bp或1 887 bp)。牛MSTN基因序列分析表明仅有一个转录起始位点在转录起始密码子ATG上游133 bp处。在绵羊中存在一个接合突变体，它移除了一部分受体结合区域的编码序列，包含256个氨基酸。这个接合突变体是MSTN基因的拮抗因子，其所编码的蛋白可以与MSTN蛋白相结合从而发挥拮抗作用，抑制MSTN介导的信号通路[7]。

3 肌肉生长抑制素作用的信号通路

与其他TGF-β超家族成员一样，MSTN通过激活素受体来介导信号传导。活化的MSTN与激活素受体ActⅡB结合发挥功能，抑制细胞增殖和分化。激活素受体是跨膜的丝苏氨酸激酶，分为Ⅰ型受体和Ⅱ型受体。Ⅰ型受体ActRⅠ(ALK4和ALK5)有唯一的Gs区域，该区域在细胞内与激酶区域相邻；而ActRⅡ受体没有这一区域[8]。MSTN与ActRⅡB结合后再与Ⅰ型受体组装，使其Gs区域磷酸化。因此，MSTN的信号是通过激活两个受体的复合物来介导的[8]。

MSTN通过ActRⅡB发挥的信号调控对于骨骼肌生长是决定性的。研究发现，人类的ActRⅡB自然缺失会导致肌肉含量显著的增加；在鼠类中，阻断这一受体也得到了相同的结果。但是研究也发现，在MSTN敲除的小鼠中用sActRⅡB(ActRⅡB的可溶形式，可以作为MSTN的诱饵受体)处理，肌肉量增加15％～25％。这表明除了MSTN之外，还至少存在一种配体能够与受体结合，来调控骨骼肌的量。这就可以解释为什么在临床试验中阻碍MSTN对于肌肉重量没有显著的影响[9]。该发现表明，MSTN不是调控肌肉萎缩的信号通路中的唯一配体。还有研究表明，在一个特定的水平上，MSTN可以阻止恶质病中肌肉萎缩[10]。

骨骼肌含量的维持是通过两种分子机制起作用：蛋白合成和蛋白降解。尽管关于MSTN在调控骨骼肌生长方面了解较多，但其发挥作用的具体机制尚不清楚。有研究表明，MSTN与ActRⅡB的结合导致Smad2或Smad3的羟基端区域2个丝氨酸残基磷酸化，使得Smad2/Smad3与Smad4结合形成异源二聚体，这个二聚体可以转移到细胞核，进而激活靶基因的转录[11]。最近的研究表明，几个MSTN的结合蛋白，包括GDF相关的血清蛋白1(GASP-1)、血清蛋白2(GASP-2)和卵泡抑素(Follistatin，FSTN)可以抑制MSTN与ActRⅡB的结合而调控MSTN信号通路[12]。

肌肉细胞的决定和最终分化都是由一个具有4个生肌调节因子(myogenic regulatory factor，MRF)的调控网络所支持：生肌因子5(MYF5)、肌肉特异性调控因子4、6(MRF4、MYF6)、成肌细胞决定蛋白(myoblast determination protein， MyoD)和肌细胞生成素(myogenin，MyoG)。MYF5和MyoD被认为是决定因子，而MyoG是对于最终成肌细胞分化定型起到关键作用[13]。成对盒蛋白3(paired box 3，Pax3)基因作为MRF的上游基因，能通过控制Dmrt2的表达而激活MYF5，Dmrt2反过来会激活体节中Myf5的增强子[14]。缺失Pax3和MYF5的小鼠，其躯体肌肉几乎不发育，MyoD的表达会下调。这表明MyoD的表达依赖于Pax3或MYF5[15]。目前还不能确切了解Pax3怎样激活MyoD的表达，但使用前体体节外植块的实验已经证明WNT信号通路通过依赖于Pax3的方式调控MyoD的表达[16]。

由此可以初步得出，MSTN的功能发挥可能是通过以下方式进行的：活化的MSTN与其受体ActⅡB结合后使Smad2/3磷酸化，Smad2/3是一个甲基转移酶，可以通过溴结构域蛋白BRD4调控MSTN的表达[17]。磷酸化的Smad2/3与Smad4结合形成复合物，而Smad7会抑制这一过程[11]。形成的Smad2/3和Smad4的复合物通过抑制Pax3的活性从而抑制MYF5/MRF4的活性，进而抑制MyoD和MyoG的活性，并最终抑制肌生成[15]。

4 Myostatin通路与其他信号通路之间的关系

MSTN除了能够与其受体结合从而发挥功能外，还可以与其他信号通路产生对话。肌肉生长的一个主要的正调控因子是胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)[18]。在正常条件下，IGF-1信号似乎是主导的而且会阻断MSTN通路。而且一般认为，IGF-1是哺乳动物真正的生长调节因子，研究已经表明哺乳动物的IGF-1基因是介导生长激素(growth hormone，GH)发挥促生长效应的主要因子。GH通过与生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)结合，可以产生IGF-1，从而调节生长发育[19]。IGF-1调控MSTN信号途径的机制包括对转录因子的抑制，转录因子的抑制是通过PI3K/Akt信号通路激活而导致的磷酸化所实现的。当IGF-1与其配体结合后，激活PI3K/Akt信号通路，使Akt磷酸化，导致叉头转录因子(forkhead box class O，FoxO)的活性受到抑制，使其停留在细胞质中而不发挥作用，从而抑制肌肉萎缩基因表达。而MSTN可以通过抑制Akt磷酸化，从而提高FoxO活性，提高肌肉萎缩基因的表达[20]。

Akt磷酸化后会导致GSK-3β的激活，周期蛋白E是细胞周期中G1期的重要成分，也通过PI3K/Akt通路受到调控[21]。MSTN下调后，使得 Akt磷酸化而抑制cyclin E的磷酸化[22]，使cyclin E与CDK2结合激活了CDK2的活性，解除Rb蛋白对S期基因转录因子E2F的抑制，促进DNA复制起始复合物的组装、着丝粒复制，以及S期组蛋白基因转录，使细胞通过G1/S期检验点进入S期，从而促进增殖和分化。

mTOR是Akt下游的一个激酶，会使4E-BP1和p70s6k磷酸化，因此会诱导蛋白合成的起始[23，24]。在MSTN敲除的小鼠中，Akt/mTOR/p70s6K信号增加[25]，所以激活的Akt诱导产生mTOR信号，导致蛋白合成。

TGF-β信号通路与Notch信号通路之间也存在相互作用，激活Notch信号通路可以抑制TGF-β信号，下调MSTN的转录，从而导致肌肉增加[26]。Dlk1(delta-like 1 homolog)是Nocth信号通路的配体， Dlk1通过与MSTN信号通路发挥作用来抑制肌管形成，从而抑制成肌细胞的分化[27]，但是具体机制尚不清楚。还有研究表明，在肌肉形成过程中存在Wnt信号，可以通过依赖和不依赖β-catenin的方式发挥作用，虽然其与MSTN的信号通路之间作用机制还不清楚，但是已经证明了wnt4可以通过抑制MSTN活性而刺激肌源性分化[28]。

关于MSTN与其他因子之间的互作关系，在总结了已有研究的基础上，我们做了一些补充和修改。如图1所示，有4条通路调控肌肉发育与分化。①FSTN抑制MSTN与其受体ActⅡB的结合，从而抑制MSTN信号通路[29]。②当活化的MSTN与其受体ActⅡB结合后，使Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3与Smad4结合形成复合物[11]，Smad7会抑制这一过程。形成的Smad2/3和Smad4的复合物抑制Pax3的活性，从而抑制MYF5/MRF4活性，抑制MyoD和MyoG的活性[15]，从而抑制肌生成。③当活化的MSTN与其受体ActⅡB结合后，会抑制PI3K活性，抑制Akt的磷酸化[20]，从而激活FoxO。FoxO进入细胞核，激活MuRF1/atrogin1，导致蛋白降解[14，30，31]；活化的FoxO与Smad2/3和Smad4的复合物相互作用，导致蛋白的降解[32]，从而抑制肌肉生成。④GH与其受体结合产生IGF-1，IGF-1与其受体结合激活PI3K，激活的PI3K可以使Akt磷酸化，进而使FoxO磷酸化抑制其活性；激活GSK-3β抑制cyclin E的磷酸化，促进cyclin E与CDK2结合成为复合体，从而激活CDK2，促进细胞G1/S期的过渡，促进细胞增殖；激活mTOR促进蛋白合成，促进肌生成[21]。

图1 在肌肉发育与分化过程中MSTN与其他因子之间的互作关系

5 MSTN敲减后对于肌肉发育相关基因的影响

在小鼠中，MSTN无义的动物其骨骼肌显著增加，且与野生型相比其脂肪含量显著下降[1，33]。Ríos等[3]发现，鼠MSTN的cDNA重组体瞬时转染C2C12成肌细胞时，可以有效地抑制细胞增殖。本实验室采用过表达载体分别与干扰载体和无义干扰载体共转染牛肌肉卫星细胞时，发现MSTN下调后，引起foxO1、dlk1基因的表达量下调，而FSTN、IGF1、myoD、myoG、GHR、CDK2和pax3基因的表达量上调。

5.1MSTN和Dlk1

Dlk1(delta-like 1 homolog)是表皮生长因子家族成员[34]，Dlk1在骨骼肌生长发育中发挥重要作用。有研究证明，Dlk1通过与MSTN信号通路共同发挥作用来抑制肌管形成，从而抑制成肌细胞的分化[27]，但是具体机制尚不清楚。该研究同时证明MSTN与Dlk1的表达呈负相关[27]，即MSTN是肌肉发育负调控因子，Dlk1同样可以抑制成肌细胞分化。由此可以认为MSTN与Dlk1发挥协同作用。

5.2MSTN和FoxO1

FoxO在骨骼肌发育的基因表达调控中起到关键作用[34]。转录因子FoxO是Fox家族重要成员，包括FoxO1、FoxO3、 FoxO4和FoxO6[35]。研究证明MSTN可以抑制Akt磷酸化，从而提高FoxO活性，达到提高肌肉萎缩基因表达的目的[20]。在MSTN下调后，也下调了FoxO1的表达。这可能是因为FoxO1可以结合于MSTN启动子区域，增强启动子活性，从而上调MSTN基因的表达[14]。所以在MSTN表达下调的情况下，FoxO1的活性也会得到负反馈调节，从而其表达量下降。

5.3MSTN和FSTN

FSTN是一种单链糖蛋白，是TGF-β超家族成员的天然拮抗剂。FSTN与MSTN结合通过抑制其与受体的结合而抑制其活性[36]。在体内过表达FSTN导致肌肉肥大，与MSTN无义的小鼠中观察到的现象一致[37]。FSTN突变的纯合体小鼠肌肉量减少[38]，表明FSTN在调控肌肉生成过程中发挥重要作用。本实验室研究发现，在牛肌肉卫星细胞中，敲减MSTN后，FSTN的表达量得到了提高。

5.4MSTN和IGF-1、GHR

肌肉生长的一个主要的正调控因子是IGF-1。在正常条件下，IGF-1信号似乎是主导的，而且会阻断MSTN的通路[39]。GH通过与GHR结合，可以产生IGF-1，IGF-1和GHR对骨骼肌发育起到正调控作用，可以促进肌肉的生长和发育[40]。在下调MSTN后，定量检测发现IGF-1和GHR基因表达得到了上调[41]。

5.5MSTN和Pax3、MyoD、MyoG

MyoD和MYF5是肌肉特异的转录因子，组成一个交叉的转录调控网络，这个调控网络对于肌肉细胞的决定和分化起到核心作用[42]，这个网络的破裂会完全取消骨骼肌的形成。MYF5和MyoD基因被认为是决定基因，MyoG是肌细胞终末端分化的关键因子，促进单核成肌细胞向多核肌细胞的融合过程[43]。在敲减MSTN后，通过实时定量的方法检测发现Pax3、MyoD和MyoG的表达量都得到了下调。这可能是因为MSTN通过TGF-β超家族信号蛋白Smad3介导抑制Pax3的下调[44]，再由Pax3介导MyoD和MyoG的下调，从而抑制肌分化[45，46]。

5.6MSTN和CDK2

CDK2 是细胞周期因子[47]，研究发现将CDK2 的抗体注入细胞或是抑制CDK2 的表达后，细胞会停留在G1期[48], 因此认为CDK2 是细胞进入和通过细胞周期S期所必需的。在下调MSTN后，CDK2的活性增强。这可能是由MSTN下调后，使得Akt磷酸化，从而抑制cyclin E的磷酸化[49]，使cyclin E与CDK2结合，从而激活了CDK2的活性，解除了Rb蛋白对S期的基因转录因子E2F的抑制，促进DNA复制起始复合物的组装、着丝粒复制，以及S期组蛋白基因的转录，使细胞通过G1/S期检验点进入S期，从而促进增殖和分化。

6 肌肉生长抑制素基因操作的应用研究

在山羊成肌细胞[50]、成纤维细胞[51]、鸡胚胎成纤维细胞[52]以及绵羊胚胎中[53]用RNAi技术干扰MSTN基因都会导致MSTN表达下调，促进细胞分化和增殖。Hu等[54]获得了RNAi干扰MSTN的转基因羊，其MSTN的表达被明显抑制，转基因羊体重增加加快，肌纤维直径增加。Kinouchi等[55]通过去端肽胶原修饰siRNA，使其在体外激活并注射入小鼠骨骼肌中，这种方法解决了传统质粒载体的不安全因素，是临床应用的一个有效手段。Zheng等[56]在绵羊胎儿成肌细胞中通过同源重组技术成功地定点诱变了陶赛特羊的MSTN基因，使其3′UTR区上游281 bp的G突变成A，并证明该突变可以有效地下调MSTN基因的表达。Zhou等[57]通过锌指核酶技术敲除了五指山小型猪的MSTN基因，并验证发现敲除MSTN基因不会对其胚胎的发育潜力造成不利影响，这为生产敲除MSTN的家畜物种提供了安全保障。Xu等[58]设计了一对针对于哺乳动物MSTN基因保守区的TALEN序列，并证明这段TALEN序列在人、牛和鼠的细胞系中可以高效特异地敲减MSTN的表达。

敲减或敲除MSTN能够促进肌肉生长，已经成为培育高产肉量家畜品种的技术手段。Luo等[59]利用锌指核酸酶技术成功培育出敲除MSTN的新型鲁西黄牛个体，具有明显的双肌臀性状。MSTN基因的变化对于动物及人体健康也非常重要。通过对MSTN基因进行基因操作或使用抗体敲减或敲除MSTN，能够增加肌肉量和维持葡萄糖稳态以缓解肌肉减少性肥胖[60]。Jackson等[61]研究发现，在中年鼠中缺失MSTN，其脂肪含量明显下降，瘦肉明显增加，这表明敲减MSTN可以减缓老化带来的病理学症状；但其心脏相对于对照组也较重，这可能会引起扩张性心脏疾病，所以还需要进一步的研究来证明敲减MSTN对于心脏功能是否有不利影响。目前，在动物模型中已经有用抗MSTN的疗法治疗肌肉萎缩症的报道。MSTN主要的抑制剂包括MSTN前肽、抗体以及GASP1和FSTN。抑制MSTN增加骨骼肌含量后可以有效抑制糖尿病的发生，缓解食欲过盛等现象[62]。另外，有研究表明，MSTN在许多肿瘤细胞系中也有表达[63]，这或许提示我们癌症的发生与肌肉的发育存在关联。最新的研究发现，MSTN可以引发明显的线粒体代谢的改变，并发现MSTN在调控癌细胞的线粒体代谢和凋亡中发挥重要功能[64]。因此，未来对于MSTN的研究也应该着重于探索MSTN控制的肌肉发育与机体其他组织的代谢通路之间的相互作用，只有把机体不同组织之间相互关联研究清楚后，才能够更好的应用于动物生产与人类临床实践。

综上所述，MSTN基因在肌肉发育中具有重要的调控作用，深入研究MSTN基因作用机制及其与其他信号通路的互作关系，对改善动物肌肉生长性状和培育高产肉量家畜品种有重要的指导作用，对人类肌肉萎缩、老化、糖尿病及其他相关疾病甚至癌症的治疗具有重要意义。

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