银杏叶提取物对大鼠视神经损伤后Bcl-2和Bax表达的影响

章 静，吴香丽，刘丽霞，赵慧英，刘 彦

(1.河北省玉田县医院眼科，河北 玉田 064100； 2.北京老年医院眼科，北京100095)

·论著·

银杏叶提取物对大鼠视神经损伤后Bcl-2和Bax表达的影响

章 静1，吴香丽2，刘丽霞1，赵慧英2，刘 彦2

(1.河北省玉田县医院眼科，河北 玉田 064100； 2.北京老年医院眼科，北京100095)

目的观察银杏叶提取物(ginkgo biloba extract，EGb761)对大鼠视神经损伤的再生作用。方法设立3个组，正常组不做任何处理，对照组和治疗组采用视神经夹伤方法，制作视神经不完全损伤模型。伤后1h，对照组给予0.05mL生理盐水球后注射，治疗组给予EGb761 0.05mL(100mg/kg)球后注射，均隔日1次，直至处死；采用HE染色观察各组视网膜及视神经组织形态学变化，免疫组织化学法测定各组视神经中B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2基因相关的X蛋白(BCL2-Associated X Protein，Bax)阳性细胞的多少以及Bcl-2/Bax的变化，以此推断EGb761对受损视神经的再生作用。结果视神经组织中Bcl-2阳性细胞在实验的第3、7、14、28天治疗组较正常组与对照组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。视神经组织的Bax阳性细胞在实验的第3、7天，治疗组较正常组显著升高(P<0.05)，较对照组显著降低(P<0.05)，第14、28天治疗组较正常组及对照组无明显变化(P>0.05)。治疗组Bcl-2/Bax比值在第3、7、14天时一直处于较高水平，第28天时开始降低，但仍较对照组高。结论EGb761能减轻外伤性视神经损伤后视神经损害，降低视神经组织Bax蛋白表达，增加Bcl-2蛋白表达，提高Bcl-2/Bax比值。EGb761对外伤性视神经损伤有一定的促再生及修复作用。

视神经损伤；银杏；大鼠

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.03.031

视神经损伤可导致严重的视力障碍，因此寻找有效的药物阻止或延缓视神经损伤病变的发展，减轻或延迟视神经损害，是视神经损伤研究的一个主要方面。银杏叶提取物(ginkgo biloba extract，EGb761)主要有效成分为银杏黄酮和银杏内酯，其在心血管疾病[1-2]、抗癌及神经系统退行性疾病[3]等方面的应用已有不少报道。本实验制作大鼠视神经不完全损伤模型，采用球后注射的给药方式，通过检测凋亡相关基因B淋巴细胞瘤2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和Bcl-2基因相关的X蛋白(BCL2-Associated X Protein，Bax)在大鼠视神经夹损伤后的表达，观察EGb761促视神经再生的作用，旨在为EGb761治疗视神经损伤的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料：EGb761购自博奥森生物公司；一抗(均为兔抗IgG多克隆抗体)购自Santa Cruze 公司；SP9001试剂盒及DAB显色剂购自北京中山生物技术有限公司；健康雌性8周SD大鼠60只(由河北省实验动物中心提供)，体质量(250±10)g，实验前10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，外眼及眼底检查均无病变者纳入实验。Nikon尼康光镜显微照相机购自日本株式会社尼康公司；LEICA RM2125石蜡切片机购自莱卡上海分公司 ；医学图象分析系统购自厦门麦克奥迪仪器仪表有限公司。

1.2 方法：60只SD大鼠随机分3组，每组20只，20眼，正常组不做任何处理。对照组和治疗组制作大鼠视神经损伤模型，10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉动物，碘伏消毒眼周围皮肤，轻柔操作，沿角膜缘处剪开颞侧球结膜，剪断外直肌，弯剪钝性分离暴露视神经，仔细分离视神经周围血管，不能损伤血管，在球后2mm处用压力恒定78g反向镊(尖端1mm宽)夹闭视神经10s，直接眼底镜观察眼底，无视网膜出血，有动脉血液供应者纳入实验，夹闭球结膜，涂红霉素眼膏。对照组于伤后1h右眼给予0.05mL生理盐水球后注射，进针1cm，隔日1次，直至处死；治疗组伤后1h右眼给EGb761(生理盐水配制)0.05mL(100mg/kg)球后注射，具体操作和时间均同对照组，各组左眼均不做处理。

在3、7、14、28d每组随机选取2只，10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉动物，碘伏消毒右眼周围皮肤，麻醉后以无菌处理的眼科剪及平镊沿角膜缘剪开球结膜，钝性分离暴露视神经，玻璃体内注射4%多聚甲醛0.01mL，防止视网膜皱缩，投入4%多聚甲醛固定液，用于免疫组织化学指标的测定。

各组大鼠视网膜及视神经组织进行HE染色，观察视网膜及视神经形态学改变；视神经组织免疫组织化学测定Bcl-2和Bax的改变及Bcl-2/Bax的比值。

2 结 果

2.1 视神经组织Bcl-2的表达：Bcl-2表达阳性的细胞主要在胞质着色，胞核也可见到，呈弥漫或散在棕黄颗粒。正常组视神经中Bcl-2阳性细胞表达较弱，呈弱阳性表达。在3、7、14和28d本无明显变化。对照组Bcl-2阳性细胞3d升高，7d开始下降，14d降至正常水平以下，28d时继续维持在正常水平以下。治疗组Bcl-2阳性细胞3d增高，7d时继续增高，14d时虽稍有下降仍处于较高水平，28d时下降较明显。

3、7d对照组Bcl-2阳性细胞平均光密度值较正常组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)； 14d及28d对照组Bcl-2阳性细胞平均光密度值较正常组显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。3、7、14及28d治疗组Bcl-2阳性细胞平均光密度值较正常组显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。3、7、14、28d治疗组Bcl-2阳性细胞平均光密度值较对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组不同时间点 Bcl-2阳性细胞平均光密度值变化 值)

*P<0.05与正常组比较 #P<0.05与对照组比较(重复测量设计资料的方差分析)

Bcl-2:B-cell lymphoma-2

2.2 视神经组织Bax的表达：Bax表达阳性的细胞主要在胞质着色，胞核也可见到，呈弥漫或散在棕黄颗粒。正常组Bax阳性细胞在3、7、14、28d基本无明显变化。对照组Bax阳性细胞3d时升高，7d时仍处在较高水平，14d时下降至正常水平，28d时继续维持在正常水平。治疗组Bax阳性细胞3d时增高，7d时已开始下降，14d时将至正常水平，28d时继续维持在正常水平。

3、7d对照组Bax阳性细胞平均光密度较正常组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，14、28d对照组与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3、7d治疗组Bax阳性细胞平均光密度较正常组显著升高,差别有统计学意义(P<0.05)；14、28d治疗组与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。3、7d治疗组Bax阳性细胞平均光密度较对照组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；14、28d治疗组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组不同时间点Bax阳性细胞平均光密度值变化 值)

*P<0.05与正常组比较 #P<0.05 与对照组比较(重复测量设计资料的方差分析)
Bax：BCL2-Associated X Protein

2.3 视神经组织中Bcl-2/Bax比值比较：视神经组织Bcl-2/Bax比值在3、7、14、28d 4个时间点,正常组分别为1.117、1.115、1.119、1.115，对照组分别为1.123、1.016、1.032、1.017，治疗组分别为1.679、1.881、1.831、1.367。治疗组 Bcl-2/Bax比值3、7、14d时一直处于较高水平，28d时开始降低，但仍较正常组比值高。

3 讨 论

视神经是具有中枢神经特征的周围神经，由视神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)胞体发出的轴索和视神经胶质细胞组成，不含神经元胞体和室管膜细胞，成分单一。RGCs为终端分化的神经细胞，其轴突组成视神经的纤维部。所谓再生或视神经的修复再生即是指RGCs轴突的再生而不是指胞体。研究[4]表明视神经钳夹伤后，视网膜神经元存在凋亡，是导致视网膜神经节细胞及内核层、外核层神经元死亡的重要方式。既往研究[5]认为视神经损伤以后再生困难，近年来随着研究的增多和深入，证明在特定的环境下视神经是可以再生的，但目前尚没有明确的治疗方法。EGb761具有多种多样的生物学效应，它的主要药理作用有：①对细胞代谢及某些酶的作用；②对激素和受体的作用；③对线粒体的保护作用；④清除自由基。许多研究[6-8]表明EGb761可以改善脑和中枢神经系统的血液供应，保护神经细胞免受损伤，改善神经退行性病变和衰老引起的认知能力的下降及提高记忆力，在阿尔茨海默病神经系统凋亡方面的治疗已得到肯定。在心血管方面具有减少血管痉挛、保护血管内皮细胞损伤、降低血液黏稠度、抗氧化活性、抑制血小板激活因子的活性、清除自由基、抗炎、抗变态反应等药理作用。研究[9]表明EGb761注射液可增加健康绝经后女性冠状动脉血流。细胞凋亡是细胞在基因指导下的主动死亡形式，基因调控在细胞凋亡过程中起重要作用。凋亡相关基因可分为凋亡促进基因和凋亡抑制基因2种。这两类基因相互作用的结果决定细胞是生存还是凋亡。目前认为Bcl-2的高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引发的细胞凋亡[10]。本实验中应用EGb761的治疗组在实验各阶段Bcl-2蛋白表达均较正常组及对照组显著增多，说明EGb761能促使Bcl-2蛋白表达增多，且能使其较长时间维持在较高水平，从而间接抑制细胞凋亡。而Bcl-2家族成员之一Bax具有促进细胞凋亡的作用，是典型的凋亡促进基因。本实验中Bax阳性细胞平均光密度在实验第3、7天时均较正常组及对照组显著降低，说明EGb761有抑制Bax细胞增多的作用，有些学者认为Bcl-2与Bax 2种蛋白的比例是决定细胞是否凋亡的关键[11]。本实验中治疗组 Bcl-2/Bax比值第3、7、14天时一直处于较高水平，第28天时开始降低，但仍较正常组高，说明EGb761能够增加Bcl-2/Bax比率。由此我们推断EGb761通过增加Bcl-2蛋白的表达和减弱Bax蛋白的表达来抑制视神经损伤后RGCs细胞凋亡，从而起到减低视神经损伤，促进其修复的作用。实验中单独设立正常组而不用实验鼠左眼作为正常组目的是为避免实验大鼠因右眼受伤后引起对侧眼凋亡基因表达异常的影响因素。

本研究结果表明EGb761对视神经的再生与修复有一定的治疗作用，其促再生作用是通过抑制凋亡实现的。由于EGb761有多种多样的生物学效应，也有实验研究[12]发现EGb761能抑制大鼠颅内C6胶质瘤细胞生长，作用机制可能与抑制胶质瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡有关。可能对凋亡的调节有双向作用，也可能在促视神经损伤修复作用中有多种多样的机制共存，这有待进一步探讨。

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2013-02-25；

2013-06-17

唐山市科学技术研究与发展计划项目(13130290b)

章静(1979-)，女，河北玉田人，河北省玉田县医院主治医师，医学学士，从事眼科疾病诊治研究。

R774.6

B

1007-3205(2014)03-0336-03

刘斯静)