含酮替芬的罂粟碱液对静脉“桥”血管保护作用的研究

殷巍 王亮 马方明 王晓明 韩志伟

作者单位：014040 内蒙古自治区，包头市中心医院心外科

含酮替芬的罂粟碱液对静脉“桥”血管保护作用的研究

殷巍 王亮 马方明 王晓明 韩志伟

作者单位：014040 内蒙古自治区，包头市中心医院心外科

目的探讨并对比分析含富马酸酮替芬的罂粟碱液与常规罂粟碱保存液对冠脉旁路移植术静脉“桥”血管的保护作用，选择能最大限度地保护静脉血管壁内皮细胞（VEC）及血管内膜完整性的保存液，提高其在临床上行冠脉旁路移植术后大隐静脉“桥”血管的远期通畅率。方法筛选20例行冠状动脉旁路移植术（CABG）的患者，取其CABG术后剩余的大隐静脉（GSV）并分割成2段，常温下分别保存在常规罂粟碱液（对照组）及含富马酸酮替芬的罂粟碱液（实验组）中各1 h。①采用酶联免疫分析法（ELISA法）检测GSV“桥”血管内皮细胞黏附分子-1（ICAM-1）浓度的表达值；②利用高倍光镜观察血管“桥”肌层的肌纤维板、内皮细胞形态结构及单位面积血管内皮细胞的死亡数目；③采用ELISA法检测血管内皮素-1（ET-1）浓度的表达情况。结果①实验组ICAM-1浓度的表达值低于常规对照组，光镜下“桥”血管内皮肌层肌纤维板及单位面积VEC的死亡分级中Ⅰ级损伤低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级损伤差异无统计学意义（P＞0.05）。②实验组内皮细胞ET-1的含量略低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论含富马酸酮替芬的罂粟碱液能够有效地抑制静脉“桥”血管内皮细胞黏附因子的表达，降低单位面积VEC的死亡数目及细胞器的损伤程度。在CABG术中可以选取含富马酸酮替芬的罂粟碱液作为桥血管的保存液，更好地保持术后远期的通畅性。

冠状动脉旁路移植术； 内皮细胞； 远期通畅率； 保存液

冠状动脉旁路移植手术（coronary artery bypass graft，CABG）是目前国内外公认的治疗冠心病最有效的方法之一[1]。现已证明，在静脉“桥”再狭窄的病理发展过程中，组胺释放及平滑肌细胞增生占据了重要作用[2]。富马酸酮替芬具有拮抗组胺H1受体、抑制血管平滑肌增生痉挛并提高NO合酶表达等作用[3]。研究表明，在手术离取大隐静脉（GSV）时操作轻柔并以含富马酸酮替芬的保存液保存GSV“桥”血管，能一定程度上改善“桥”血管内膜内皮细胞及肌层纤维板的结构，起到保护“桥”血管肌层肌纤维板结构及血管内膜、内皮细胞结构的相对完整性。本课题就是从GSV“桥”血管保存液方面着手研究。目前国内外利用含有富马酸酮替芬罂粟碱保存液的报道较少，且酮替芬能拮抗组胺H1受体、抑制血管平滑肌增生痉挛等作用已经得到证实[4]。

1 材料与方法

1．1 标本来源 筛选20例于包头市中心医院心血管外科（2009年1月至2010年1月）行CABG的住院患者，分别取其冠脉旁路移植术后剩余的大隐静脉。

1．2 方法

1.2.1 实验步骤 本实验分两个阶段进行。第一阶段：筛选20例行CABG的患者（20例大隐静脉均为同一组手术人员离取），取其冠脉旁路移植术后剩余的大隐静脉分成2段，酶联免疫吸附试验（ELISA）的标本每段重约3 g，HE染色试验标本长度约2 cm。分为两组：实验组（含富马酸酮替芬的罂粟碱液组）n=20；对照组（常规婴粟碱液组）n=20。两组均采用相同的扩充液、相同的扩张压强及扩充时间，两组分别用不同的保存液各保存1 h进行比较。以上各标本按实验要求分别保存在0.9%盐水和15%甲醛中，ELISA实验组标本予-60℃冰箱中保存。保存液的成分及浓度详细的配置方法[5,6]：对照组，肝素（6250 U/ml）0.5 ml+罂粟碱盐 360 mg的林格液300 ml；实验组，在对照组保存液中加入富马酸酮替芬（加拿大MYDrags产），并将浓度调至100 μg/ml。

第二阶段：标本各保存1 h。①将大隐静脉标本分别取1 cm用石蜡包埋切片后经HE染色，利用光镜观察内皮细胞的形态、结构、肌纤维板等的损伤情况[7]。②血管内皮细胞黏附因子-1（ICAM-1）的标本处理：切割标本，称取量1 g，加入磷酸缓冲液（PBS液，pH=7.4），保持温度在 2℃～8℃（本实验控制在4℃，数据由预实验获得），利用匀浆器充分匀浆，用DL7M-12L离心机离心3～5 min（转速2500 r/min），取离心后的上清液2 ml，利用ELISA法检测两组ICAM-1浓度的表达值。③内皮素-1（ET-1）标本的处理：将组织吸去血迹，切割成质量1 g的段，加入1 g蒸馏水（H2O）细细研磨8 min，40℃水浴中6 min，匀浆，温度4℃；离心机高速离心（3000 r/min）15 min后取上清液，用ELISA法测定ET-1浓度。

光镜下比较上述两组保存液保存后的GSV内膜、肌层肌纤维板及VEC的损伤情况；通过酶联免疫吸附实验检测ICAM-1浓度的表达值及ET-1含量的不同，实验组与对照组经SPSS 11.5统计学统计对比后，获得对GSV损伤最小的保存液，以此为临床提供增加GSV“桥”血管远期通畅的理论依据。

1.2.2 观察血管细胞损伤的分级标准 光镜：根据每高倍镜视野下血管内膜的表层内皮细胞及肌纤维板所占比例分为4级：比例＞75%为Ⅰ级，50%～75%为Ⅱ级，25%～50%为Ⅲ级，＜25%为Ⅳ级[8]。

1.2.3 采取各实验方法的依据

1.2.3.1 光镜下观察血管细胞情况 光镜下观察VEC的形态、结构及肌层纤维板等的损伤变化，依据上述分级标准进行分级，从而对实验组和对照组进行统计分析，这符合国内外的判断标准。

1.2.3.2 ELISA法检测ICAM-1的浓度表达值 采用组织匀浆法，测量ICAM-1表达的浓度，通过两组保存液对血管内皮细胞浓度的不同表达情况，判断两组保存液的不同保存效果。该方法在国内外都有应用，可以使实验结果相对准确。

1.2.3.3 ELISA法检测ET-1 将组织制成匀浆，3000 r/min离心后取上清液，检测ET-1浓度的表达，通过两组保存液对血管ET-1浓度的表达差异，判断两组保存液的不同保存效果。该方法基于目前国内外对ET-1表达水平与血管粥样硬化（AS）致使血管狭窄的研究[9]，并且这与国内外的相关报道一致。采用该方法，可以使实验结果比较准确，且更有说服力。

1．3 统计学方法 所有的数据经SPSS 11.5统计分析软件处理。ELISA实验数据以±s表示，计数资料用χ2检验分析（四格表χ2检验），同质受试对象间的资料采用配对样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组光镜结果比较 含富马酸酮替芬的罂粟碱液作为GSV桥血管保存液保存后的血管，利用光镜观察其内皮细胞脱落情况，Ⅰ级损伤占90%，Ⅱ级损伤占10%，Ⅲ级损伤无，Ⅳ级损伤无，管壁固有膜、基层细胞排列整齐，细胞很少变性；常规罂粟碱保存液作为GSV桥血管保存液保存后的血管，利用光镜观察其内皮细胞脱落情况，Ⅰ级损伤占55%，Ⅱ级损伤占40%，Ⅲ级损伤占5%，无Ⅳ级损伤，管壁固有膜、肌层细胞排列较紊乱，细胞变形较多。（见表1，图1～3）。观察结果经统计学分析处理，Ⅰ级损伤差异有统计学意义，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级损伤均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两组经不同保存液保存后光镜结果比较（例）

2．2 两组ICAM-1比较 应用含富马酸酮替芬的罂粟碱保存液保存后的“桥”血管，ELISA法检测ICAM-1的浓度表达值，实验组与对照组ICAM-1浓度分别为（32.20±7.70）ng/ml和（36.69±5.75）ng/ml，实验组ICAM-1浓度明显低于常规罂粟碱组，差异有统计学意义（t=-2.454，P＜0.05）。

2.3 两组ET-1比较 应用含富马酸酮替芬的罂粟碱保存液保存后的“桥”血管，ELISA法检测ET-1的浓度表达情况，实验组与对照组ET-1浓度分别为（21.10±7.30）ng/L 和（21.69±7.71）ng/L，实验组ET-1浓度低于常规罂粟碱组，差异有统计学意义（t=-2.117，P＜0.05）。

3 讨论

目前，冠状动脉旁路移植手术是治疗冠心病最有效的方法之一。动脉管腔虽然比大隐静脉有较高的远期通畅率，术后10年通畅率达到90%，但自体大隐静脉也有易于获得、材料丰富、安全性能好等独特的优点，长期以来一直被临床上作为标准的搭桥材料[2]。但随着时间延长，其缺点也逐渐为心脏外科医生所掌握。长期随访结果表明，冠状动脉搭桥术后10年仅有60%的移植静脉保持通畅[3]。可见，CABG术后静脉桥血管再狭窄严重影响了冠心病患者的预后。因此，如何提高静脉桥血管的远期通畅率成为目前冠心病外科领域研究的热点。桥血管获取过程中的牵拉、充盈、保存条件及缺血缺氧环境，都可能直接或间接地引起桥血管内皮细胞的损伤、脱落及体液因子的改变，引起血管内皮功能障碍，促进桥血管粥样硬化形成，从而影响CABG的成功率和远期通畅率[8,9]。为了减轻对桥血管内皮的损伤程度，将CABG桥血管放入保存液中进行保存。保存液的种类有肝素化的生理盐水、罂粟碱保存液、硝酸甘油-维拉帕米保存液（gv-保存液）等，临床上常用罂粟碱保存液对桥血管进行保护。本课题从CABG桥血管保存液的角度进行研究，为寻求新型保存液，增加对桥血管内皮细胞的进一步保护，提高桥血管的远期通畅率，进而改善CABG术后患者的生活质量提供理论依据。本实验前通过预实验得出实验组均优于对照组的结论。

从大隐静脉的形态结构上看，其管壁分为三层：内膜、中膜和外膜。内膜和中膜较薄，外膜较厚。其中内膜的结构是否完整对桥血管的近远期通畅率起着关键的作用[10]。内膜主要由大量的内皮细胞和少量的胶原纤维构成，是血管壁与流动的血液之间的界面，担负着血液与组织之间能量交换及运输通透性屏障的任务；同时，内皮细胞还具有抗血栓形成、保持内膜完整性的重要作用。内皮细胞通过感知血流力度、理化及体液因素的刺激等变化，能够合成并分泌ICAM-1、mcsf、NO等多种生物活性物质，而作出相应的代偿性应答，防止或减轻发生粥样硬化的可能[11]。ICAM-1的表达在这个过程中起着重要的作用[11,12]。再加上CABG术中获取GSV时，由于对桥血管的“外力”损伤是不可避免的，因此，针对桥血管采取必要的保护措施，以减少VEC对黏附因子的表达，对提高桥血管的远期通畅率是非常重要的。本实验数据统计结果显示，Ⅰ级损伤χ20.05=6.144，P＜0.05，差异有统计学意义，说明CABG术中离取“桥”血管的过程中，内膜及肌层的肌纤维板不可避免地都要受到轻微的损伤，这和前述关于CABG术后“桥”通畅率低的理论分析相吻合，只是损伤的轻重程度有所不同，含酮替芬组与常规组相比对内皮损伤较轻一些，并且在两组中Ⅰ级损伤占绝大比例，而这种损伤属于最轻度损伤；Ⅱ级损伤 χ20.05=4.80，P＞0.05，Ⅲ、Ⅳ级均无统计学意义，而此时根据内皮损伤的分级加重，较重度的损伤比例反而减少甚至没有，这进一步说明了CABG术中用GSV“桥”血管没有严重的损伤，可以用于搭桥。从光镜结果理论上分析，可以得出含富马酸酮替芬的罂粟碱保存液略优于常规保存液组。通过ELISA法检测组织ICAM-1浓度表达情况来看，P 值为 0.024（P＜0.05），有统计学意义，由酮替芬保存后的“桥”血管ICAM-1表达较常规组明显偏低，说明富马酸酮替芬组在保存血管时，通过其拮抗组胺H1受体、抑制血管平滑肌增生痉挛并提高NO合酶表达等作用，有效地防止了大隐静脉的痉挛，使VEC处在一个相对平衡稳定的温和环境中，VEC受到外界刺激因素导致的损伤大大减轻，细胞脱落及变性都较少，因此对ICAM-1的表达很低。含富马酸酮替芬的罂粟碱组优于常规罂粟碱组的原因可能与富马酸酮替芬对血管作用的如下机制有关：①稳定细胞膜，抑制肥大细胞脱颗粒而减少组胺、肥大细胞蛋白水解酶的释放，从而抑制组胺作用于H1受体激活，减少花生四烯酸的释放，调节细胞内Ca2+的浓度，维持循环血液在血管内的流动状态，防止血小板的聚集和早期血栓形成，从而降低血管壁粥样硬化的发生率，提高静脉桥血管的近远期通畅率。②降低血管壁的通透性，抑制其合成前列环素和NO的速率；同时减少VEC多种AM受体的表达，降低或阻断中性粒细胞的快速聚集和白细胞的附壁，这个机制可能是含富马酸酮替芬的罂粟碱组ICAM-1的OD值低于常规罂粟碱组的原因之一。与此对比，常规罂粟碱液容易损伤血管内皮超极化因子（EDHF）介导的内皮依赖性舒缩活动，加大血管壁的张力，高张力下更容易造成VEC内膜的损伤，导致VEC对ICAM-1的表达偏高，甚至伤及肌层的肌纤维板和外膜[13-17]；同时，ICAM-1又是整合素-1的重要配体，两者结合会导致中性粒细胞和内皮细胞的黏附，成为VEC损伤和功能障碍的基础。在这种条件下黏附因子表达增加，加强了细胞间的黏附，是血管疾病发生、发展的重要阶段[15]。这可能是目前CABG术后桥血管远期通畅率偏低的原因之一。综上所述，在对桥血管内皮细胞表达的ICAM-1及血管组织、结构的保护效果方面，含富马酸酮替芬的罂粟碱组优于常规罂粟碱组。

内皮素（ET）是由21个氨基酸残基组成的短肽，共有三种异构体：ET-1、ET-2和 ET-3，它们都通过和ET受体（有ETA和或ETBR两种）结合发挥作用。其中ET-1主要产生于血管壁，且极易与血管内皮细胞分泌的ETBR结合，介导血管的收缩反应，是目前已知最强大的血管收缩因子。虽然ET-1本身的血浆循环浓度很低（以pg来记），不足以引起血管收缩，但是ET-1在VEC分泌的各种黏附因子等的共同作用下会发生强烈的缩血管作用；同时，ET-1的合成调节在转录水平，许多因素如血管活性物质、生长因子、炎性介质及缺血、缺氧等均可促进其释放，然后与内皮素B受体（ETBR）牢固结合，产生持久的缩血管作用，甚至引起血管强烈痉挛，产生严重的不良后果，进而影响桥血管的远期通畅率。王春喜等[9]发现，ET-1水平升高可能是血管狭窄加剧的标志，这与国内外的报道相一致。所以，本实验从能否进一步降低桥血管表达ET-1浓度的角度对两种保存液进行对比，为临床上选择一种性能更好的保存液奠定基础，为进一步提高桥血管的远期通畅率寻求更好的保存方法。通过实验证实（t=-2.117，P＜0.05），由含富马酸酮替芬的罂粟碱液保存后的“桥”血管，ET-1表达的浓度较常规罂粟碱组略偏低，其原因可能与富马酸酮替芬对血管作用的以下机制有关：酮替芬能够有效抑制组织肥大细胞中磷酸二酯酶的活性，致使肥大细胞中的环磷酸腺（cAMP）水平升高，减少Ca2+内流，遏制血管壁对内皮素-1的过度表达，从而减低ET-1的浓度。常规罂粟碱液不能有效调控血管组织中磷酸二酯酶的活性表达，可能是导致血管表达ET-1浓度水平偏高的原因之一。因此，通过本实验对血管组织表达ET-1研究的结果显示，含富马酸酮替芬的罂粟碱保存液与常规罂粟碱保存液相比，能更有效地降低血管表达ET-1的水平。因此，从是否能够有效降低血管表达ET-1浓度水平的角度判断，含富马酸酮替芬的保存液用于CABG术中桥血管的保存，可能较明显地防止或延缓血管粥样硬化的发生，更好地保护桥血管，有效提高桥血管的远期通畅率。从而得出结论：含富马酸酮替芬的罂粟碱保存液可以代替常规罂粟碱保存液应用于临床。

综上所述，经含富马酸酮替芬的罂粟碱保存液保存后的桥血管，光镜下显示内皮肌层肌纤维板及内皮细胞损伤相对较小，组织血管对ICAM-1的表达相对较低，ET-1反应浓度相对常规组略偏低。在理论上可以得出初步结论：含富马酸酮替芬的罂粟碱保存液对桥血管的损伤较小，与常规罂粟碱保存液相比，更适合作为CABG术中桥血管移植前的保存液。

含酮替芬的罂粟碱液对静脉“桥”血管保护作用的研究

图1 HE染色实验照片（×200）

图2 HE染色实验照片（×200）

图3 HE染色实验照片（×100）

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A study of protection effect on veins“bridge”in contained ketotifenor papaverine liquid

YIN Wei，WANG Liang，MA Fang-ming，et al.Cardiovascular Surgery of BaoTou Central Hospital，Baotou 014040，China

ObjectiveTo study and analyze two preservation solutions containing Ketotifen Fumarate Papaverine and conventional Ketotifen at the same time in protective effects on the“bridge”graft of coronary artery bypass grafting choose preservation solution that can largely protect the venous wall endothelial cells （VEC）and the vascular intimal integrity to improve its long-term patency of saphenous vein grafts in clinical after coronary artery bypass grafting（CABG）.MethodsScreening 20 patients with coronary artery bypass grafting（CABG）.The remaining saphenous vein after CABG were divided into two sections，respectively stored in conventional poppylye（control group）and contain rich fumaric acid for findan poppylye ketone（group）in each hour at ambient temperatures.⑴The enzyme-linked immunoassay assay（ELISA）was performed to measure the concentration of expressionendothelial cell adhesion moleculebridge-1（ICAM-1）.⑵Observe the muscularis neoplasm board,endothelial cells，morphology and unit area of endothelial cell death at high magnification.⑶The concentration of endothelin-1（ET-1）was measured by using ELISA.Results⑴The expression of ICAM-1 levels in experimental group lower than that in control group.DeathⅠ level in grading of the muscularis neoplasm board and unit area of endothelial cell death at high magnification significantlylower than that in control group（P＜0.05）. Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ-level damage was no significant differences（P＞0.05）.⑵The expression of ET-1 levels in endothelial cells at experimental group lower than the control group significantly（P＜0.05）.ConclusionContain rich fumaric acid for findan poppylye testosterone can restrain venous bridge endothelial cell adhesion express，reduce the factor of the VEC per unit area of the number of deaths and organelles.In CABG surgery can select papaverine solution with Keto－tifen Fumarate grafts as the preservation fluid to keep the better long-term patency after surgery.

Coronary artery bypassgrafting； Endothelialcells； Long-term patency rate；Preservation solution

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．01．019

R654.2

A

1672-5301(2014)01-0059－05

2013-05-29）