心肌特异性miR-133a与cTnT早期诊断急性心肌梗死的价值

李颖庆 卢建华 王西富 李欣 胡春林 廖晓星

临床研究

心肌特异性miR-133a与cTnT早期诊断急性心肌梗死的价值

李颖庆 卢建华 王西富 李欣 胡春林 廖晓星

目的比较血循环中心肌特异性miR-133a与肌钙蛋白T（cTnT）在急性心肌梗死（AMI）早期诊断中的价值。方法收集67例AMI患者和32名非AMI对照者的血浆标本，通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）测定血浆中miR-133a水平，同时通过电化学发光法检测血浆cTnT的变化。结果AMI患者血浆中miR-133a水平较非AMI对照者明显升高（P＜0.01），而当这些AMI患者康复出院时miR-133a水平已回落到基线。MiR-133a水平的波动与研究对象的自身特征无相关性（P＞0.05）。受试者工作特征曲线（ROC）分析表明，miR-133a在早期诊断AMI方面具有显著的心肌特异性和敏感性，但并不优于cTnT。结论血浆miR-133a可作为AMI早期诊断的标志物，但在诊断价值上并不优于cTnT。

miR-133a； 肌钙蛋白T； 急性心肌梗死； 标志物

就世界范围而言,急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）已成为临床主要的死亡原因，但是可以通过早期诊断、尽早干预，有效地降低AMI所致的高死亡率。目前在临床诊断AMI时，肌钙蛋白 T（Cardiac troponin T，cTnT）是早期诊断的“金标准”，因为cTnT对心肌损伤具有高度的特异性和敏感性[1]。然而，也有研究发现，终末期肾病患者cTnT的血浆浓度也明显升高，可作为慢性肾功能衰竭的一项血浆标志物[2]。因此，寻求对早期诊断AMI具有更高特异性的生物标志物很有必要。

微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）是一族由19～25个核苷酸组成的内源性、非编码小RNA[3]，能够调控基因表达，并在多个病理生理过程中发挥重要作用[4]。研究发现，miRNAs具有组织及细胞特异性，并在各种状态下对细胞及组织功能发挥重要作用[5]。特别是近期研究报道，在外周血浆中可检测到miRNAs的存在，并可随着机体病理生理状态的改变发生相应的表达变化，这表明miRNAs也许可以作为特定疾病的生物诊断标志物[6]。已有研究显示，AMI发生时，外周血浆中某些miRNAs的表达可发生相应的变化，这表明心肌特异性miRNAs也许可作为AMI诊断的生物标志物[7-11]。

本研究目的是通过检测外周血浆中miR-133a和cTnT在AMI患者中的表达，分析miR-133a诊断AMI的可行性，并比较miR-133a与cTnT的诊断价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 共有67例AMI患者纳入本项研究，另外有32名非AMI志愿者作为对照。AMI的诊断依据最新的指南[12]：肌钙蛋白（cTn）较99%正常上限升高/降低1倍以上，同时结合：①缺血性胸痛；②新出现的显著ST段及T波改变或新出现的左束支传导阻滞；③ECG出现进展性的病理性Q波；④影像学证实新发的存活心肌丢失或室壁运动异常；⑤冠脉造影或尸检证实有冠脉内血栓。

1.2 血浆的采集和保存 研究组病例的静脉血标本（3 ml）分别在AMI症状出现后12 h内和14 d时采集，由于病情变化的缘故，在第14天时有18例患者的血浆标本纳入研究；32名非AMI对照者的静脉血标本未区分时间段。所有静脉血标本均用EDTA抗凝管收集，4℃1000 g离心10 min以分离血浆。将分离出的血浆4℃14 000 g离心15 min，取上清液置于无RNA酶的EP管中，存储于-80℃备用。

1.3 总RNA抽提 血浆中总RNA采用TRIzol LSR试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）进行抽提，操作过程参考相应说明。提取的总RNA溶于10μl DEPC水中，RNA含量及浓度通过BioPhotometer（Eppendorf）进行测定。

1.4 定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）从每份血浆样本抽提的总RNA中取0.5μg，加入miRNA特异性引物及M-MLV逆转录酶（Promega，Madison，WI，USA）构成反应体系，采用由瑞博公司（中国，广东）提供的Bulge-LoopTMmiRNA qRTPCR专用引物进行实时定量PCR检测miR-133a的表达，操作过程参照相应说明，加入秀丽杆线虫miRNA（cel-miR-39）作为标准内参[6]。反应参数设定：①42℃，60 min；②70℃，10 min。最后将cDNA产物贮存于-20℃备用。

运用PRISM 7900HT系列检测系统（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA） 进行 qRT-PCR 反应。20μl反应体系中含有2μl逆转录产物cDNA，2μl前向引物（5μm），2μl通用PCR引物（5μm），9μl Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG reagent（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），5 μl超 纯水。整个反应体系先95℃孵育2 min，然后40个循环（95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s），再从 60 ℃加热至95℃获得相应的融解曲线。反应过程中未加入作为阴性对照逆转录酶或模板，每个反应体系安排3个副孔。采用2-ΔΔCt法分析miR-133a基因的相对表达量[13]。

1.5 cTnT检测 血浆cTnT含量测定应用电化学免疫荧光法，具体过程参照2010免疫荧光电化学试剂盒（Roche Diagnostics，Switzerland）相应说明书进行，cTnT＜0.04 ng/ml定义为正常参考值。

1.6 统计学方法 统计学分析采用SPSS 16.0软件包。所有数据除特殊标注外，均采用±s的形式，AMI与对照组病例的临床特征数据的比较采用t检验或Fisher′s检验。MiR-133a在AMI和对照病例间表达的差异运用Mann-Whitney检验。AMI病例不同时间点间血浆miR表达差异的两两比较采用Wilcoxon检验。受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC） 用于分析 AMI病例与对照组间的差异。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的临床特征 本研究中共纳入67例AMI患者，另32名非AMI志愿者作为对照，临床特征资料见表1。AMI病例平均年龄（63.84±11.17）岁，对照组平均年龄（61.75±9.58）岁，两组之间差异无统计学意义（P=0.332）。研究组与对照组性别构成均是男性居多（AMI组52名男性，对照组22名男性），差异无统计学意义（P=0.343）。AMI组病例入院时平均 cTnT 水平为（1.30±1.06）ng/ml，与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）。研究组与对照组间各自临床特征方面差异无统计学意义。见表1。

2.2 循环miR-133a在AMI患者中的表达水平为了检测循环miR-133a在AMI患者中的表达水平，我们分析了血浆miR-133a在AMI病例及对照组中的表达差异。如图1所示，与对照组相比，AMI组病例血浆miR-133a明显升高（P＜0.01）。

另外，我们也检测了出院时AMI组病例与对照组外周血浆miR-133a表达的差异，发现AMI组病例的miR-133a水平已回复到基线水平，与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

2.3 循环miR-133a具备AMI早期诊断潜力我们应用ROC曲线分析miR-133a是否具备早期诊断AMI的价值。如图3所示，miR-133a的ROC曲 线 下 面 积 （areas under ROC curve，AUC）为0.9468 ［95% 可 信 区 间 （confidence interval，CI）0.9057～0.9879］；与之相应，cTnT 的 AUC 为 0.9820（95%CI 0.9289～0.9975）。上述结果显示，循环 miR-133a对心肌梗死反应的特异性和敏感性具备早期诊断AMI的潜力，但并不优于cTnT。

3 讨论

图1 入院时血浆miR-133a在AMI组病例与对照组中的表达

图2 出院时血浆miR-133a在AMI组病例与对照组中的表达

图3 miR-133a与cTnT诊断AMI的特异度与敏感度的ROC综合分析

表1 研究对象的临床特征［±s，例数及百分率（%）］

表1 研究对象的临床特征［±s，例数及百分率（%）］

cTnT（ng/ml）对照组 32 61.75±9.58 22/10 13（40.63） 5（15.63） 15（46.88） 14（43.75） 125.56±12.52 79.75±6.81 0.03±0.02 AMI组 67 63.84±11.17 52/15 32（47.76） 13（19.40） 38（56.72） 36（53.75） 129.66±15.35 81.57±9.76 1.30±1.06 P值 0.332 0.343 0.505 0.649 0.358 0.353 0.203 0.210 ＜0.01组别 例数 年龄（岁） 男/女 吸烟 糖尿病 高血压 高脂血症 收缩压（mm Hg）舒张压（mm Hg）

通过对入组的AMI患者采血进行miR-133a含量变化的分析，我们发现，入院当天、胸痛出现12 h内miR-133a水平显著升高，与对照组比较差异具有统计学意义；分析数据表明miR-133a表达量的变化与AMI的进程相一致。研究报道，在AMI的早期阶段，将很快出现心肌缺血、缺氧、水肿及坏死，坏死心肌释放物如肌钙蛋白（cTnT）、肌酸激酶（CK-MB）和脑利钠肽（BNP）释放入血循环中，这些生物标志物已用于AMI的早期诊断。有关研究发现，miR-133a在缺血再灌注的心肌细胞中表达降低，在经过缺血预处理后表达增加，有助于减少因缺血再灌注损伤所致的心肌梗死面积，并能保护心肌细胞，减少心肌酶类的释放；而且当miR-133a的类似物转染入心肌细胞后有抑制心肌细胞凋亡的作用。我们认为，在AMI的早期阶段，miR-133a也可以从坏死心肌中释放出来进入血循环而标志AMI的进程。因此，我们选择miR-133a进行AMI早期诊断的研究[14]。

流行病学研究显示,AMI是世界范围内发病率和死亡率极高的疾病，每年发病率为300万～400万。再灌注疗法的早期实施可显著降低AMI的死亡率，因此，在AMI的早期阶段进行及时准确的诊断尤为重要。根据ESC/ACC对心肌梗死的共识，诊断AMI时，cTnT比CK-MB、BNP或C-反应蛋白具有对坏死心肌更高的敏感性和特异性[15，16]。然而，cTnT仍有不足之处。有报道指出，cTnT在终末期肾病中有明显升高，可作为肾功能衰竭预后诊断的生物标志物[4,17]。因此，有必要寻求对早期诊断AMI具有更高特异性及敏感性的生物标志物。

近年来的研究发现，miRs在不同状态下具有组织和细胞特异性，此外，miRs可被释放到循环中并保持稳定状态[7]。一系列相关研究显示，血循环中心肌特异性miRs的表达水平，伴随心血管疾病的不同进程而发生相应改变，这意味着miRs有可能成为AMI诊断的新的生物标志物[18]。

本研究的结果与近期的文献报道是一致的，循环miR-133a在AMI阶段升高，并明显高于非AMI对照组循环血中miR-133a的表达水平；在AMI患者出院时，循环miR-133a又回落至正常水平。与此同时，我们也分析了AMI阶段cTnT表达的变化。cTnT是目前临床广泛应用的AMI诊断生物标志物，能反映AMI梗死范围的大小。与cTnI相比，cTnT对早期诊断AMI具有更高的敏感性和特异性[19]。

我们运用ROC曲线分析miR-133a与cTnT在早期诊断AMI中的价值。结果显示，miR-133a在早期诊断AMI方面具有明确的心肌特异性和敏感性，具备作为AMI诊断生物标志物的可行性。尽管结果也显示miR-133a在AMI过程中的表达变化与cTnT有着良好的一致性，但ROC曲线分析并未发现miR-133a优于cTnT。

根据上述结果分析，cTnT在AMI的早期诊断方面具有比miR-133a更高的敏感性和心肌特异性，因此我们推测，在AMI患者胸痛症状出现前就有cTnT从坏死心肌中释放出来进入循环。既往的研究已明确cTnT主要结合于心肌肌原纤维上，而miRNAs主要结合于细胞基质蛋白复合体。我们认为，也许正是这些差异导致了心肌坏死阶段释放cTnT和miRNAs的不同。有鉴于此，miRNA-133a与cTnT联合检测有助于对终末期肾病并发AMI的早期诊断。

通过此项研究我们认为，miR-133a在AMI早期诊断中有一定价值，并与cTnT进行了相应比较。结果表明，miR-133a可作为早期诊断AMI的生物标志物；然而其诊断AMI的特异性和敏感性并不优于cTnT。由于cTnT在终末期肾病中也有明显升高，我们认为miR-133a与cTnT联合早期诊断AMI具有更大的优势，可以提高敏感性和特异性，防止假阳性结果的出现。

［1］Jaffe AS，Ravkilde J，Roberts R，et al.It’s time for a change to a troponin standard.Circulation，2000，102：1216-1220.

［2］Khan NA，Hemmelgarn BR，Tonelli M，et al.Prognostic value of troponin T and I among asymptomatic patients with end-stage renal disease：a meta-analysis.Circulation，2005，112：3088-3096.

［3］Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，et al.Identification of novel genes coding for small expressed RNAs.Science，2001，294：853-858.

［4］Soifer HS，Rossi JJ，Saetrom P.MicroRNAs in disease and potential therapeutic applications.Mol Ther，2007，15：2070-2079.

［5］Kloosterman WP，Plasterk RH.The diverse functions of microRNAs in animal development and disease.Dev Cell，2006，11：441-450.

［6］Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al.Pogosova-Agadjanyan EL.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：10513-10518.

［7］Wang GK，Zhu JQ，Zhang JT，et al.Circulating microRNA：a novel potential biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in humans.Eur Heart J，2010，31：659-666.

［8］Bostjancic E，Zidar N，Stajer D，et al.MicroRNAs miR-1，miR-133a，miR-133b and miR-208 are dysregulated in human myocardial infarction.Cardiology，2010，115：163-169.

［9］Ji X，Takahashi R，Hiura Y，et al.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury.Clin Chem，2009，55：1944-1949.

［10］ Dong S，Cheng Y，Yang J，et al.MicroRNA expression signature and the role of microRNA-21 in the early phase of acute myocardial infarction.J Biol Chem，2009，284：29514-29525.

［11］Tijsen AJ，Creemers EE，Moerland PD，et al.MiR423-5p as a circulating biomarker for heart failure.Circ Res，2010，106：1035-1039.

［12］ Thygesen K，Alpert JS，Jaffe AS，et al.Third universal definition of myocardial infarction.Circulation，2012，126：2020-2035.

［13］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2［-Delta Delta C（T）］Method.Methods，2001，25：402-408.

［14］He B，Xiao J，Ren AJ，et al.Role of miR-1 and miR-133a in myocardial ischemic postcofitioning.J Biomed Sci，2011，18：22-25.

［15］Myocardial infarction redefined-a consensus document of the JointEuropean Society ofCardiology/American College of Cardiology Committee for the redefinition of myocardial infarction.Eur Heart J，2000，21：1502-1513.

［16］陈峰，庞继恩，孙强，等.急性心肌梗死患者冠状动脉循环血清高肌钙蛋白T含量变化及意义.中国心血管病研究，2012，10：355-357.

［17］Van Rooij E，Liu N，Olson EN.MicroRNAs flex their muscles.Trends Genet，2008，24：159-166.

［18］王泽，鲍贤豪，秦升.微小RNA在心血管疾病中的意义及临床应用.中国心血管病研究，2011，9：471-474.

［19］Reiter M，Twerenbold R，Reichlin T，et al.Early diagnosis of acute myocardial infarction in the elderly using more sensitive cardiac troponin assays.Eur Heart J，2011，32：1379-1389.

Comparing the early diagnostic values of plasma miR-133a and cardiac troponin T in patients with acute myocardial infarction

LI Ying-qing＊，LU Jian-hua，WANG Xi-fu，et al.＊Emergency Department of Guangzhou First People′s Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China

LI Ying-qing，E-mail：hare0914@aliyun.com.LU Jian-hua，E-mail：doctorlujh@126.com

ObjectiveTo evaluate the expression of plasma cardiac-specific miR-133a in acute myocardial infarction（AMI）and compare their diagnostic values with that of cardiac troponin T（cTnT）.MethodsSixtyseven plasma samples obtained from patients with AMI and thirty-two plasma specimens collected from non-AMI volunteers were analyzed in this study.The level of cardiac-specific miR-133a was detected by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction（qRT-PCR），and the level of plasma cTnT was detected using electrochemiluminescence-based methods on the Elecsys 2010 Immunoassay Analyzer.ResultsThe level of plasma miR-133a was significantly increased in AMI patients（P＜0.01）compared with non-AMI volunteers.The expression of the cardiac-specific miR-133a in AMI patients decreased to close to the baseline at the time of hospital discharge（P＞0.05）.There was no correlation between the level of circulating miR-133a and the clinical characteristics of the study population（P＞0.05）.Furthermore，receiver operating characteristic（ROC）curve analyses showed that miR-133a was cardiac-specific and sensitive for the diagnosis of early AMI，but not superior to cTnT.ConclusionThe present study showed that the plasma miR-133a may be useful biomarker for AMI but is not superior to cTnT for the diagnosis of AMI.

MiR-133a； Cardiac troponin T； Acute myocardial infarction； Biomarker

国家自然科学基金（项目编号：81372023）

510180 广东省，广州市第一人民医院急诊科（李颖庆、卢建华、王西富）；中山大学附属第一医院急诊科（李颖庆、李欣、胡春林、廖晓星）

李颖庆，E-mail：hare0914@aliyun.com；卢建华，E-mail：doctorlujh@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2014．01．002

R542.2+2

A

1672-5301(2014)01-0004－05

2013-11-04）