鸡胚胎干细胞多能性相关基因cNanog和cPouV干扰载体的构建及筛选

彭特 王丙云 李东升 陈志胜 陈胜锋 计慧琴 陈金顶

在哺乳动物和人中，Oct4、Nanog和Sox2被认为是调控干细胞多能性及自我更新的3个重要的转录因子［1-3］，但它们在家禽干细胞中的作用存在争议。2001年Soodeen等［4］研究表明，鸡体内不存在Oct4，Lavial等［5］的研究发现鸡胚胎干细胞表达Oct4同源基因鸡PouV（cPouV），并且对其多能性的调控有重要作用。本实验室的前期研究显示，在鸡早期胚胎发育过程中，多能性相关基因cNanog、cPouV和Sox2显著表达，但随着胚胎发育3个基因的表达量呈明显的下降趋势，在鸡胚胎干细胞分化的过程中，cNanog、cPouV和Sox2的表达水平也显著下降，导致细胞多能性的丧失，提示这3个基因在维持鸡胚胎干细胞多能性中发挥重要作用［6-8］。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是双链RNA（dsRNA）介导的遗传干扰现象，它能够特异有效地降解mRNA，从而引起转录后水平的基因沉默，导致相应功能基因表型缺失［9］。1998年首次在秀丽线虫中发现RNA干扰现象，不久后在真菌、植物、果蝇、锥虫、涡虫、水螅、斑马鱼等真核生物中都发现了RNA干扰现象［10，11］，RNA干扰技术具有高效、快速和成本低廉的优势，现已经成为研究基因功能、新基因筛选、基因治疗和寻找药物靶点的重要工具［12，13］。

为进一步阐明cNanog和cPouV基因在鸡胚胎干细胞多能性维持和自我更新中的作用，本试验分别针对鸡多能性相关基因cNanog和cPouV设计3对siRNA干扰片段，合成shRNA插入到干扰载体中，构建siRNA表达载体，并对其进行筛选，以期获得良好的干扰载体和转染技术，为获得cNanog和cPouV基因稳定干扰的CES细胞株，阐明cNanog和cPouV基因在鸡胚胎干细胞多能性调控中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜受精鸡蛋（麻黄鸡）购于广东省佛山市南海种禽有限公司；pCMV-N-Flag、pSuper-Retro-Puro和pEGFP-N1质粒由广州医科大学蔡铭升博士惠赠；实验所用的限制性内切酶、DNA Marker、逆转录试剂盒和RNAiso Plus均为大连TaKaRa公司产品；T4DNA连接酶为NEB公司产品；KOD酶购自东洋纺公司；质粒小量提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒为上海生工公司产品；DYKDDDDK-Tag Mouse mAb和Actin Mouse mAb为Abmart公司产品；山羊抗小鼠IgG（H+L）和超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天研究所；PVDF膜购自Millipore公司；寡核苷酸和引物由Invitrogen公司合成；测序由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 cNanog和cPouV基因 siRNA 表达载体的构建 根据siRNA的设计原则，通过Ambion公司在线siRNA靶位点设计软件（http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_tools.html）针对 cNanog（NM_001146142）和 cPouV（NM_001110178）基因分别设计3条寡聚核苷酸序列（表1）。合成的寡聚核苷酸配制成100μmol/L的浓度，与互补的寡聚核苷酸片段混合后用退火缓冲液（100mol/L NaCl、pH7.450mmol/L HEPES）稀释成终浓度3pmol/L。90℃4min，70℃ 10min孵育，缓慢冷却至室温。退火后形成的shRNA连接到经Bgl II和Hind III酶切的pSuper-Retro-Puro质粒中，连接产物转化DH5α感受态细胞、挑取克隆摇菌后送测序公司测序。提取测序正确的干扰载体，保存用于后续试验，分别命名pS1-cNanog、pS2-cNanog、pS3-cNanog和 pS1-cPouV、pS2-cPouV、pS3-cPouV。

表 1 合成的用于构建干扰载体的寡核苷酸序列

1.2.2 cNanog和cPouV全基因表达载体的构建 用Clone Manager软件设计扩增cNanog和cPouV基因的特异性引物，分别在扩增cNanog基因的引物引入BamH I和EcoR I，cPouV基因引入EcoR I和Sa lI酶切位点（表2）。采用本实验室改进的方法取新鲜种鸡蛋的胚盘［14］，按照说明书采用Trizol法提取总RNA，并用AMV逆转录酶和Oligo（dT）18引物合成cDNA，以合成的cDNA为模板按照下列参数进行PCR 扩增 ：94℃ 5min；94℃ 30s，退火 30s，72℃50s，循环35次；最后72℃ 10min。PCR 产物回收纯化后用双酶切，回收目的片段与经同样酶切及回收的pCMV-N-Flag载体连接，转化后挑选阳性菌落进行PCR与酶切鉴定以及测序验证，将构建正确的重组质粒分别命名为pCMV-Flag-cNanog和pCMVFlag-cPouV。

表2 cNanog和cPouV基因的PCR引物序列

1.2.3 pSuper-shRNA、pCMV-Flag重组表达载体和pGFP质粒共转染293T细胞 采用磷酸钙法转染293T细胞，转染前1d选择对数生长期的293T细胞接种于6孔板，待细胞生长至80％汇合时取4μg pSuper-shRNA、4μg pCMV-Flag 重 组 质 粒 和 0.5μL pGFP-N1质粒加入到100μL CaCl2溶液中，混匀，将混合液缓慢滴加入100μL 2×HBS中，剧烈混合后加入6孔板中，继续培养细胞。

1.2.4 Western blot法检测重组载体的干扰效果 3个siRNA表达载体和全基因表达载体以及pGFP质粒共转染293T细胞24h后，观察荧光以确定转染效率，然后提取细胞蛋白进行Western印迹，以未转染siRNA表达载体组为阴性对照，β-actin作为内源性对照。

293T细胞用预冷的PBS洗涤两次，6孔板按100μL/孔加细胞裂解液，在冰上震荡20min后重悬，12000g 4℃离心5min。经SDS-PAGE分离后，电转移至PVDF膜上。膜封闭后分别用抗Flag（1∶3000），抗 β-actin（1∶3000）抗体 4℃孵育过夜，与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（1∶1000）室温反应1h，用化学发光法检测目标基因在干扰前后的表达变化。

2 结果

2.1 siRNA 表达载体的构建

用pSuper-Retro-Puro质粒为基础质粒进行siRNA表达载体的构建，载体含有氨苄抗性基因，表达载体连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于LB氨苄青霉素抗性平板培养过夜，挑取单克隆培养并提取质粒，重组质粒测序验证与预期相符，部分测序结果见图1。

图1 重组质粒pS3-cPouV的测序比对图

2.2 cNanog和cPouV全基因表达载体构建与鉴定

经PCR扩增cNanog和cPouVcDNA编码区全长，1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图2）显示扩增出长约946bp的cNanog和905bp的cPouV目的片段；将重组质粒pCMV-Flag-cNanog和pCMV-Flag-cPouV分别用BamH I、EcoR I和EcoR I、Sal I进行双酶切后，电泳图谱显示分别切出与插入的预期目的大小相符的DNA 条带（图3）。进一步的测序结果表明，插入片段的核苷酸序列与GenBank公布的cNanog和cPouV参考序列完全相同，表明重组质粒构建成功。

图2 cNanog和cPouV目的片段PCR产物电泳图谱

2.3 质粒转染293T细胞效率的估测

载体转染24h后，荧光显微镜下检测 pGFP转染效果，可见约70％-80％的293T细胞发出绿色荧光（图4），由于共转染时加入的pGFP质粒的浓度及体积一样，从侧面可反映出重组干扰载体的转染效率情况。表明磷酸钙介导的重组干扰载体转染293T细胞效率较高且不同质粒间无明显差异。上述试验独立重复5次以上，结果均一致。

图3 pCMV-Flag重组质粒双酶切产物电泳图谱

图4 GFP与不同质粒共转染293T细胞表达情况（24h，100×）

2.4 cNanog和cPouV 干扰片段效率检测

分别用cNanog和cPouV基因的3种pSupershRNA和pCMV-Flag重组表达载体共转染293T细胞后，Western blot检测结果（图5）发现，所构建的重组干扰载体均有一定的抑制靶基因表达的作用。其中针对cNanog基因的干扰载体中pS3-cNanog的抑制效果最明显，pS2-cNanog次之；pSuper-cPouV-shRNA中pS3-cPouV重组载体的效果最好，pS1-cPouV和pS3-cPouV也有一定的抑制作用。上述试验独立重复3次，结果均一致。

3 讨论

鸡胚胎干细胞在胚胎发育基础、转基因禽类的生产及家禽育种等方面具有巨大的应用前景，但难以实现体外长期培养以及可传代遗传修饰，究其原因是对其全能性维持机制缺乏深入的了解。研究表明cNanog和cPouV在调控胚胎干细胞的自我更新和维持多能性上起重要作用，其在哺乳动物中的研究取得了较多的成果，但在家禽中研究报道很少。利用RNAi技术研究鸡胚胎干细胞多能性相关基因的报道更是少之又少，在国内尚未有见。本试验成功构建了针对多能性相关基因cNanog和cPouV的重组干扰载体，以期进一步深入研究其在鸡胚胎干细胞中的生物学功能。

图5 转染pSuper-shRNA 24h后cNanog和cPouV蛋白表达水平

siRNA的获得方法有多种，包括化学合成、体外转录、长片段dsRNAs经RNaseIII类降解、siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达、siRNA表达框在细胞中表达等，前3种方法的最大缺点是都需要直接操作RNA，操作不便，并且siRNA进入细胞后容易降解，RNAi效应维持时间短。为了克服这些不足，本研究采用了基于pSuper质粒表达siRNA的方式进行RNAi，不仅降低了制备siRNA的成本，简化了操作，而且延长了siRNA作用时间，便于筛选稳定表达细胞系用于研究基因的长期功能。pSuper质粒含有RNA聚合酶III识别H1启动子和一个5-6个连续的胸腺嘧啶（T）构成的转录终止位点以及选择标记［15］。本试验合成的寡核苷酸包含所选序列的正义和反义序列间用一段9nt的链（5'-TTCAAGAGA-3'）连接；同时还包含5个连续的T作为RNA聚合酶III的终止信号，预测体内转录后会形成3'端两个U突出的茎部为19bp，环为9bp的短发夹结构，从而有效模拟RNA i过程中间体［16］。且pSuper质粒带有Puro标签，转染细胞后，可使用嘌呤霉素筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。采用的真核表达载体pCMV-N-Flag的启动子CMV可以高效启动目的蛋白cNanog和cPouV在293T细胞中的表达，含有1个可以编码Flag标签的序列，可以表达出含有Flag标签的融合蛋白，便于使用抗Flag的抗体来识别目的蛋白，有利于目的蛋白检测。质粒转染细胞的方法有多种，如电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法和病毒介导法等，本试验采取的磷酸钙转染法操作简便，易于得到稳定转染，但对pH值要求较高且重复性差，因此每种质粒都反复进行了多次转染以保持稳定，转染结果不仅进一步证实了表达载体pCMV-Flag和pSuper-Retro-Puro重组质粒可以转染293T细胞，而且具有较高的转染效率。

4 结论

本试验首先构建多能性相关基因cNanog和cPouV真核表达载体与pSuper-shRNA干扰载体，鉴定插入片段与预期相符后，共转染293T细胞以表达目的蛋白。再采用Western blotting对构建的重组干扰载体进行检测与筛选，在β-actin表达量保持相对一致时，加入重组干扰质粒组的靶基因蛋白表达量较对照组有所下降，表明构建的pSuper-shRNA能特异性抑制靶基因的表达，且不同位点的序列抑制效果不同。

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