响应面法优化灵芝胞外多糖的发酵工艺条件1)

程俊文，贺亮*，李肖娟，胡传久，魏海龙，付立忠，李海波

(1.浙江省林业科学研究院，浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室，杭州310023；2.杭州雪域生物技术有限公司)

灵芝(Ganodermalucidum)是一种药用价值很高的名贵真菌，现代医学研究已证实：灵芝对多种疾病尤其是癌症、心脏病、脑血栓等严重威胁人类生命的疾病具有十分显著的疗效[1]。近年来，随着人们生活水平和保健意识的提高以及相关产品开发的拓展，仅靠野外采集或人工栽培子实体已不能满足人们对灵芝的需求，因而利用液体深层发酵技术大量而且快速地生产灵芝发酵产物的方法得到了普遍应用[2]。

响应曲面法(response surface methodogy，RSM)是建立一个包括各因素的一次项、平方项和任何两个因素之间的一级交互作用项的数学模型。近年来日益受到重视, 该方法采用可以建立连续变量曲面模型，对影响生物产量的因子水平及其交互作用进行优化与评价，从而快速有效地确定生物过程的最佳条件。目前该方法现已广泛用于发酵培养基优化、培养条件优化和酶解等生化反应优化和模型建立中[3-4]。本实验以灵芝胞外多糖为目标产物，利用Box-Behnken设计和响应面法优化发酵培养基组成来提高灵芝液体发酵胞外多糖的产量，为以后的发酵和放大实验奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

灵芝(Ganodermalucidum)：由浙江省林业科学研究院生物技术研究所实验室保藏。

1.2 培养基

1.2.1 斜面PDA活化菌种用。

1.2.2 液体种子培养基。马铃薯100g/L，葡萄糖15g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/ L。

1.2.3 摇瓶发酵基础培养基。葡萄糖20g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5g/L。

1.3 培养方法

1.3.1 斜面培养。从母种试管中切出蚕豆大小的菌丝块接种于斜面的中部，在25℃培养7d。

1.3.2 液体种子培养将活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种于液体培养基中，500mL 三角瓶装培养基150mL于25℃，150r/min培养7d。

1.3.3 发酵培养。采用二级摇瓶，500mL三角瓶装液量150mL，液体菌种接种量为10%，于25℃，150r/min培养。

1.4 实验设计

1.4.1 单因素实验

以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米粉、小麦粉取代摇瓶发酵培养基中的葡萄糖，分别进行碳源种类试验；以酵母粉、蛋白胨、豆饼粉、麦麸、牛肉浸膏取代酵母粉，分别进行氮源种类试验；以10～30g/L葡萄糖进行碳源浓度梯度试验，以2～16g/L的酵母粉进行氮源浓度梯度试验。

1.4.2 响应面法分析实验

综合单因素试验结果，选择葡萄糖、玉米粉、豆饼粉3个因素所确定的水平范围，运用Box-Behnken中心组合试验设计原理[5]，采用3因素3水平的响应面设计，利用DesignExpert8.05软件对实验数据进行回归分析。自变量的试验水平分别以-1、0、1进行编码，试验因素及水平设计见表1。

表1 响应面分析因子及水平表

1.5 分析方法

1.5.1 菌丝干重测定

取100mL发酵液，在3000r/min离心20min，经自来水洗涤多次后，将菌丝体在105℃烘干至恒重，电子天平称重。

1.5.2 胞外多糖(extracellular polysaccharides，简写EPS)的测定

收集发酵液，3000r/ min离心20min，取上清液，浓缩，加入3倍体积的95%酒精，4℃冰箱醇沉24h，4000r/min离心20min得沉淀物，用硫酸-苯酚法测定其多糖的含量[6]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

表2 不同碳源对灵芝液体发酵胞外多糖的影响

表3 起始碳源浓度对菌丝体生物量和胞外多糖产量的影响

表4 不同氮源对灵芝液体发酵胞外多糖的影响

表5 起始氮源浓度对菌丝体生物量和胞外多糖产量的影响

表2～表5的结果说明：葡萄糖、玉米粉和小麦粉都是较好的碳源，其含量对灵芝胞外多糖的积累随着浓度的增加而增大，继续增大则趋于平稳；从生产实际考虑，选择葡萄糖和玉米粉作为灵芝液体发酵培养基的复合碳源。酵母粉和豆饼粉都是较好的氮源，其含量对多糖的积累随着浓度的增大而增大，继续增到一定值反而降低；从生产实际考虑，豆饼粉价格低廉，容易获得，因此选择豆饼粉作为灵芝液体发酵培养基的氮源。

2.2 响应面分析试验结果

2.2.1 响应面分析方案及结果

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，设计3因素3水平的响应面分析试验。共有17个试验点，其中12个为析因点，5个零点试验用以估计试验误差。以胞外多糖得率为响应值，试验方案及结果见表6。

表6 响应面试验设计方案及试验结果

2.2.2 回归模型建立及方差分析

利用Design Expert 8.05软件对表6实验数据进行分析[7]，获得灵芝胞外多糖得率对葡萄糖、玉米粉和豆饼粉的多元二次回归方程：EPS(mg·L-1)=341.36+4.81X1+8.61X2+22.55X3-6.95X1X2+12.28X1X3-9.36X2X3-37.26X1X1-19.97X2X2-19.96X3X3

表7 回归模型方差分析

由表7方差分析可知，以胞外多糖含量为目标函数的回归方程的回归效果达到极显著水平，P值均<0.0001；模型的决定系数R2=0.9879，说明模型与实际实验拟合较好；校正决定系数AdjR2=0.9724，说明该模型能解释97.24%响应值的变化；模型的失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表7中模型失拟项的P值为0.0956，大于0.05，表明模型的失拟项不显著；根据表7的显著性分析结果，各因素的一次项、二次项以及X1X2、X1X3、X2X3的交互项对胞外多糖的合成均显著(P<0.05)影响；综合以上表明这个模型建立的回归方程能运用于灵芝液体发酵培养基优化的理论预测。

2.2.3 响应面图形分析

分别将模型中的葡萄糖、玉米粉及豆饼粉的其中一个因素固定在0水平，得到另外两个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线如图1～3所示，各个因素及其相互间的交互作用对响应值的影响结果通过该组图可以直观地反映出来。极值条件应该在等高线的圆心处。由几组图可以看出，影响灵芝发酵产胞外多糖最显著的因素为葡萄糖(X1)，表现为响应面变化弧度较大。玉米粉(X2)和豆饼粉(X3)响应面弧度变化平缓，说明对响应值影响相对较小。此外，等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示二因素交互作用显著，而圆形则与之相反。从图1～图3可以看出，X1与X3交互作用显著；X2与X3，X1与X2均无交互作用，表明一因素对响应值的影响规律并不会随着另一因素的改变而有明显变化。

图1 葡萄糖和玉米粉交互影响胞外多糖得率的曲面图和等高线图

图2 葡萄糖和豆饼粉交互影响胞外多糖得率的曲面图和等高线图

图3 玉米粉和豆饼粉交互影响胞外多糖得率的曲面图和等高线图

2.2.4 验证实验

通过SAS软件对上述方程进行求解，得到最佳培养条件为：葡萄糖15.79g/L，玉米粉10.23g/L，豆饼粉10.41 g/L，胞外多糖产量理论值可达348.75mg/L。

为检验模型预测值与实际实验值之间的相关性，即检验响应面优化模型的可靠性，对灵芝在预测的最优发酵条件下胞外多糖产量进行实验验证。实验中葡萄糖、玉米粉和豆饼粉的优化值分别为15.79、10.23、10.41g/L，三组平行实验，测得胞外多糖产量分别为338.79mg/L、341.04mg/L、340.32mg/L，实际胞外多糖平均值为340.05mg/L，达到了回归模型预测理论值的97.5%，实验结果与模型符合良好，说明该模型能较好地模拟和预测灵芝胞外多糖产量。

3 结论

考察了不同碳、氮源营养因子的影响，结合工业化生产实践，选择葡萄糖和玉米粉为碳源，豆饼粉为氮源，根据Box-Benhnken中心组合实验设计及三因素三水平的响应面分析，通过二次多项回归模型进行方差分析和回归拟合，预测了灵芝产胞外多糖最佳培养基条件为：葡萄糖15.79g/L，玉米粉10.23g/L，豆饼粉10.41g/L，胞外多糖产量理论值可达348.75mg/L。验证实验中胞外多糖可得340.05mg/L，与预测值十分接近，证明了该实验方法的稳定性。

[1]马礼金,姚汝华.灵芝的药用及食用研究[J].食品与发酵工业,2005,24(1)：62-66．

[2]夏至兰，周连玉,刘明月．灵芝深层发酵优良菌株的筛选[J].菌物研究，2007，5(2)：75-80．

[3]吕国英,张作法,潘慧娟,等.响应面分析法优化香菇多糖发酵培养基[J].菌物学报,2010, 29(1): 106-112.

[4]王允祥,吕凤霞,陆兆新.杯伞发酵培养基的响应曲面法优化研究[J].南京农业大学学报,2004, 27(3): 89-94.

[5]Liang RenJie. Optimization of extraction process of Glycyrrhiza glabra polysaccharides by response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers 2008,74:858-861.

[6]王光亚.保健食品功效成分检测方法[M].北京:中国轻工业出版社,2002.

[7]费荣昌.实验设计与数据处理[Z].4版.江南大学教材,2001:59-63.