壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精微球的工艺优化考察

孙玉卿，冯占芹，李志韧，郑增娟，李志坚，张维芬Δ

（1.潍坊医学院临床学院，山东潍坊261053；2.潍坊医学院药学院，山东潍坊261053；3.中国人民解放军第二炮兵中国人民解放军总医院口腔科，北京100088）

壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精微球的工艺优化考察

孙玉卿1†，冯占芹2†，李志韧3，郑增娟2，李志坚2，张维芬2Δ

（1.潍坊医学院临床学院，山东潍坊261053；2.潍坊医学院药学院，山东潍坊261053；3.中国人民解放军第二炮兵中国人民解放军总医院口腔科，北京100088）

目的壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精微球的工艺优化及特性研究。方法喷雾干燥法制备壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精微球，并采用L9（34）正交设计，通过扫描电子显微术（scanning electron microscopy，SEM）、傅立叶变化红外线光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）、示差扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）、紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometric，UV）表征微球的理化特性，优化微球制备工艺。结果壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精微球喷雾干燥的最佳工艺条件：进口温度为150℃，进料速度为8mL／min，空气流量为300 L／h，壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精的比例为1∶1∶0.33；扫描电子显微镜显示微球的形态圆整，表面有少许皱褶，无粘连；红外结果表明卵磷脂的羰基与壳聚糖的氨基及β-环糊精的羟基形成氢键；差热分析结果表明壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精微球的热稳定性降低；优化工艺制得的壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精微球的载药量、包封率为（5.08±0.18）%和（9.53±0.69）%。结论根据上述条件对壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精微球喷雾干燥工艺优化后得到的结果较满意，为壳聚糖／卵磷脂／β-环糊精微球的制备和应用提供可行的依据。

壳聚糖；卵磷脂；β-环糊精；喷雾干燥；微球

阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）是一种神经系统退行性疾病，主要特点是大脑皮层萎缩、β淀粉样蛋白沉积、胆碱能神经损伤及神经元细胞死亡等，已成为威胁人类晚年健康的一大隐患［1］。

壳聚糖（chitosan，CTS）是甲壳素脱N-乙酰基的产物，具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒、无免疫原性等优点，可作为药物载体被广泛应用于医药领域。CTS具有抗氧化和细胞保护作用［2］，研究报道CTS能通过抑制巨噬细胞激活来阻止NO及OH自由基的生成，具有缓解AD症状的作用［3］。Wilsona等［4］报道CTS作为载体，有利于药物通过血脑屏障，浓集于靶向区域，从而促进药物对AD的治疗作用。β淀粉样蛋白的产生是AD发生的一个重要诱因，Khodagholi等［5-6］报道CTS作为载体不仅能够抑制NT2神经元的细胞毒性而且能抑制氧化应激反应引发的 β淀粉样蛋白的形成。Kosicek等［7］指出卵磷脂（phosphatidylcholine，PC）与AD的发病机制有密切的关系，PC是合成神经递质“乙酰胆碱”的前体物质，能够被大脑摄取用于信息传递［8］，因此PC的缺失是导致认知功能障碍最主要的原因之一［9］。β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）不仅能够提高制剂的生物学特性而且不影响药物在肺部的沉积［10］，因此，可作为一种理想的药物辅料。

本实验将CTS作为模型药物的同时兼作载体材料，PC和β-CD作为辅料，优化喷雾干燥法制备CTS／PC／β-CD微球的工艺，并对其理化特性进行研究，为进一步开发CTS／PC／β-CD微球作为治疗AD的药物载体奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器 CTS（脱乙酰度≥85%，山东莱州市海力生物制品有限公司）；卵磷脂（上海艾维特医药科技有限公司）；β-CD（成都市科龙化工试剂厂）；Buchi B-290小型喷雾干燥仪（瑞士步琦有限公司，喷嘴直径0.7mm）；FTIR Avater-360傅里叶变换红外光谱仪（上海棱光技术有限公司）；JCM-6000 NeoScope台式扫描电镜（怡星公司）；DSC7020差热扫描分析仪（北京赛思蒙仪器有限公司）；UV-8000／8000A／8000S双光束紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

1.2 处方工艺筛选 精密称取PC及β-CD各适量，溶于200mL 1%的CTS乙酸溶液中，经0.45μm微孔滤膜过滤，根据L9（34）正交试验设计，控制进口温度（A）分别为190℃，170℃，150℃，进料速度（B）分别为12mL／min，8mL／min，14mL／min，空气流量（C）分别为700 L／h，400 L／h，300 L／h，CTS／PC／β-CD比例（D）分别为1∶1∶0.33、2∶1∶0.33、3∶1∶0.67，导入Buchi B-290小型喷雾干燥器，喷雾干燥“一步”制得微球粉末。同法制备PC／β-CD空白微球（PC／β-CD的比例为1∶0.33）。

1.3 微球形态观察 称取少许微球撒于样品盖上，喷金，然后在高压条件下进行成像观察。

1.4 红外光谱分析 2mg CTS、PC粉末及最优喷雾条件制备的CTS／PC／β-CD微球粉末、PC／β-CD空白微球粉末分别与100mg KBr固体混合压片，用Avater-360红外光谱仪测定各样品的红外光谱，扫描范围400～4000 cm-1［11］。

1.5 热分析 分别将5mg CTS、PC粉末及最优喷雾条件制备的CTS／PC／β-CD微球粉末、PC／β-CD空白微球粉末置于Al2O3坩埚中，按实验条件程序升温，从40℃开始升温至600℃，升温速度为5℃／min，对样品进行TG-DSC测试。

1.6 载药量和包封率的测定 分别精密称取CTS／PC／β-CD微球适量（微球的总质量），按照CTS／PL／β-CD的制备比例计算，约相当于100mg CTS（微球中包封和未包封的总药量），研磨，用10mL浓度为0.5mol／L的醋酸溶解后置于1000mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液1mL，置于10 mL容量瓶中，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀，在605 nm波长处分别测定吸光度值，根据标准曲线回归方程A＝0.0593C＋0.1459（n＝6，r＝0.9998），计算药物CTS在溶液中的浓度，进而得出CTS在微球中的质量（微球中的含药量），即求得微球的载药量和包封率［12］。

载药量（%）＝微球中含药量／微球的总质量×100%

包封率（%）＝微球中含药量／微球中包封和未包封的总药量×100%

1.7 统计学方法 所有实验结果重复3次，采用SPSS19.0统计软件包进行统计分析，正态计量数据用±s”表示，正态计量资料组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 正交设计优化制备工艺 采用喷雾干燥法制备的CTS／PC／β-CD微球，随着药物／载体比例的增加，微球的载药量和包封率增加（见表1）。根据载药量结果，极差分析可见，A因素3水平的主次顺序为A3→A1→A2；B因素3水平的主次顺序为B2→B1→B3；C因素3水平的主次顺序为C3→C2→C1；D因素3水平的主次顺序为D1→D2→D3。故最优喷雾条件为A3B2C3D1，即进口温度为150℃，进料速度为8mL／min，空气流量为300 L／h，CTS／PC／β-CD的比例为1∶1∶0.33，进口温度影响最大，其次是CTS／PC／β-CD比例和空气流量，进料速度影响最小。

表1 正交设计优化喷雾干燥条件Tab.1 Orthogonal design for the optimization of spray-dried operation conditions

2.2 微球形态 微球的SEM结果见图1，由图可知，微球都较圆整，表面光滑或有皱褶，微球1、3、4、6间发生粘连，且微球3、4、6表面有针状结晶，可能是未包载的CTS。CTS比例越大，微球（3、4、8）的粒径越大；空气流量越大，微球（1、6、8）间越易聚集；进口温度越高，微球（1、2、3）粒径越不均一。因此，应适当降低CTS的比例，降低进口温度，减小空气流量。按照正交试验优化的喷雾条件制备的微球粒径较均一，表面皱褶增加，分散性较好，且无针状结晶。

图1 CTS／PC／β-CD微球的SEM图片（×5000）Fig.1 SEM of spray-dried CTS／PC／β-CD microspheres（×5000）

2.3 微球红外光谱分析 微球的红外图谱见图2，β-CD在3400 cm-1处有较强的-OH吸收峰［13］，由图可知，CTS／PC／β-CD微球在3400 cm-1左右的吸收峰增强，是因为喷雾干燥后β-CD的-OH与CTS的-OH、-NH重叠所致。CTS／PC／β-CD微球在1300～900 cm-1左右吸收峰增强，是因为喷雾干燥后C-H、C-O、P-O等单键的伸缩振动和C＝O、P＝O等双键的伸缩振动增加所致，CTS／PC／β-CD微球与CTS、β-CD［13］、PC、CTS／β-CD［13］、PC／β-CD比较，在1084 cm-1处的吸收峰变宽，说明PC的C＝O与CTS的-NH及β-CD的-OH形成了氢键。

图2 红外图谱Fig.2 FTIR spectrum

2.4 微球差热分析 微球的差热分析结果见图3，从图中可看出，在100℃以下都出现了较小的吸收峰，是因为样品含有水分，为水分子的挥发和一些小分子的降解峰；CTS在289℃处出现一个小的放热峰，339℃处出现一个小的吸热峰，503℃处出现一个较宽的放热峰，分别是CTS解链、结晶、降解峰；PC在369℃处出现一个放热峰，394℃处出现一个吸热峰，518℃处出现一个较宽的放热峰，可能分别是PC侧链和主链的降解峰；PC／β-CD在374℃、375℃、377℃和511℃处分别对应的是吸热峰、放热峰、吸热峰、放热峰，与CTS和PC相比较，总吸热和放热峰增加；CTS／PC／β-CD在303℃处出现放热峰，343℃处出现吸热峰，481℃处出现放热峰，分别是微球侧链和主链的降解峰，与PC／β-CD相比较，总吸热和放热峰减少，说明CTS、PC、β-CD间发生了化学键的结合，但CTS／PC／β-CD吸热峰和降解峰的温度与PC、PC／β-CD相比较降低，说明CTS／PC／β-CD喷雾干燥后不仅形成氢键的能力降低，而且结晶能力也下降，因此，CTS／PC／β-CD微球的热稳定性降低。

图3 差热扫描图谱Fig.3 DSC thermograms

2.5 工艺验证 最佳喷雾干燥工艺的验证：按照优化的喷雾条件制备3批CTS／PC／β-CD微球，并测定载药量和包封率，试验结果为（5.08±0.18）%和（9.53±0.69）%。结果证明该喷雾条件，适合CTS／PC／β-CD微球的制备。

3 讨论

微球的外观形态不仅影响粉末的聚集程度，而且影响其在肺部的分散和沉积［14］。微球的形态与其喷雾干燥的条件有关，如微球表面皱褶的形成可能是由于在干燥和降温过程中CTS／PC／β-CD微球皱缩造成的。Chew等报道［15］表面带有皱褶的圆形微球比表面光滑的微球具有更高的呼吸分数，这是由于皱褶微球的体表面积较大，增加了药物与吸收部位的接触面积，更有利于药物在肺部的吸收，而且皱褶微球的分散性较少依赖于吸入装置和吸入气流，少量的皱褶就可达到理想的效果［16］。本实验喷雾干燥法制备的CTS／PC／β-CD微球具有皱褶结构，因此，可作为一种理想的肺部吸入药物载体。

综上所述，正交试验优化了喷雾干燥法制备CTS／PC／β-CD微球的喷雾条件，微球的形态圆整，表面有皱褶且无粘连，可作为肺部吸入药物的载体；FTIR显示PC的C＝O与CTS的-NH及β-CD的-OH形成了氢键，表明药物与载体间发生了化学键的结合；DSC表明CTS／PC／β-CD微球的热稳定性降低。

本实验主要从喷雾条件及药物／载体比例来优化制备工艺，并考察了微球的表面形态、内部结构、热稳定性、载药量、包封率等特性，后续实验中将重点研究微球的体外释放、体内外降解、生物相容性、细胞毒性以及体内药物代谢动力学和药物效应动力学的研究，考察CTS／PC／β-CD微球的安全性和有效性，为其工业化生产和临床应用奠定基础。

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（编校：王俨俨）

Study on process optim ization of the chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin m icrospheres

SUN Yu-qing1†，FENG Zhan-qin2†，LIZhi-ren3，ZHENG Zeng-juan2，LIZhi-jian2，ZHANGWei-fen2Δ

（1.Clinical College，Weifang Medical University，Weifang 261053，China；2.College of Pharmacy，Weifang Medical University，Weifang 261053，China；3.Department of Stomatology，the General Hospital of the Second Artillery Corps of Chinese PLA，Beijing 100088，China）

ObjectiveTo optimize the preparation technology of chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin microspheres and investigate their characteristics.MethodsChitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin microspheres were prepared by spray drying method optimized by the L9（34）orthogonal test.The physicochemical properties ofmicrospheres were characterized by scanning electron microscopy（SEM），fourier transform infrared spectroscopy（FTIR），differential scanning calorimetry（DSC），and ultraviolet spectrophotometric（UV）.ResultsThe optimum spray drying conditions were as follows：the inlet gas temperature was150℃，the feed flow rate was 8 mL／min，the drying air flow was 300 L／h and the ratio of chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin was 1∶1∶0.33.Scanning electron micrograph demonstrated that the microspheres were predominantly spherical with slightly wrinkled.Fourier transform infrared spectroscopy showed that the carbonyl group of phosphatidylcholine formed hydrogen bonds with the amide group of chitosan and the hydroxyl group ofβ-cyclodextrin.Differential thermal analysis displayed that the stability ofmicrospheres decreased.The drug load and encapsulation efficiency of chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin microspheres prepared by the optimum spray drying conditions were（5.08±0.18）%and（9.53±0.69）%，respectively.Conclusion The satisfied effectwas attained after optimizing the spray drying technology of chitosan／phosphatidylcholine／β-cyclodextrin microspheres，which provides the feasible basis for the preparation and application.

chitosan；phosphatidylcholine；β-cyclodextrin；spray-drying；microsphere

R944.9

A

1005－1678（2014）08－0176－04

国家科技部星火科技计划项目（2013GA740103）；山东省自然科学基金（Y2008F15；ZR2012CM025）；山东省科技攻关（2012YD18063）；山东省高等学校科技计划项目（J11LF67）

孙玉卿，女，硕士在读，研究方向：药物新剂型与新生物材料，E-mail：sunyuqing2013＠163.com；冯占芹，共同第一作者，女，硕士在读，研究方向：药物新剂型与新生物材料，E-mail：fzhanqin＠163.com；张维芬，通信作者，女，硕士生导师，博士，教授，研究方向：药物新剂型与新生物材料，E-mail：zwf2024＠126.com。