尿素包合法纯化东北柞蚕蛹油中不饱和脂肪酸的工艺研究

曲晓宇，张四喜，周利婷，宋燕青

（吉林大学第一医院药学部，吉林长春130021）

尿素包合法纯化东北柞蚕蛹油中不饱和脂肪酸的工艺研究

曲晓宇，张四喜，周利婷，宋燕青Δ

（吉林大学第一医院药学部，吉林长春130021）

目的本文对东北地区极其丰富的生物资源柞蚕蛹油中不饱和脂肪酸的纯化工艺进行研究。方法通过超临界二氧化碳流体萃取法（super critical fluid extraction technology-CO2，SFE-CO2）提取东北柞蚕蛹油，采用尿素包合法对蚕蛹油混合脂肪酸进行纯化，并利用正交设计法优化纯化条件。结果SFE-CO2萃取东北柞蚕蛹干粉中蛹油的萃取率为17.93%（w／w），不饱和脂肪酸油酸、亚油酸和α-亚麻酸占混合脂肪酸含量为22.73%。以脂肪酸-尿素-甲醇（1∶3∶10，w／w／v），包合温度－10℃，包合时间为18 h为包合条件，经一次包合后，不饱和脂肪酸纯度达到84.08%，二次包合后纯度达95.70%。结论尿素包合法纯化柞蚕蛹油中的不饱和脂肪酸方法操作简单、成本较低，是进一步开发柞蚕蛹油不饱和脂肪酸产品的可靠纯化方法。

尿素包合；东北柞蚕蛹；纯化；不饱和脂肪酸；气相色谱法

柞蚕是我国的优势昆虫资源，研究表明，柞蚕蛹油中主要含有人体必需的不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸及亚麻酸等，具有调节血脂、降低血浆总胆固醇、抗血栓形成等药理作用，国家卫生部已将柞蚕蛹列为新的绿色食品源［1］。近年来，日本、韩国等在蚕蛹的开发利用方面处于领先地位，日本已研究出无蛹臭的食用蛹油［2］。东北地区是我国传统的柞蚕主产区，柞林资源存量丰富，柞蚕生产已成为东北山区农村经济的支柱产业和民生产业。据统计，黑龙江、吉林、辽宁和内蒙古4省（区）柞蚕茧产量占全国的90%以上，占全世界的80%以上。但是目前东北地区对柞蚕蛹的开发利用则相对落后，大量柞蚕蛹被作为饲料喂养家禽而未使其高营养价值得到充分利用［3］。东北柞蚕蛹油经皂化后产生混合脂肪酸，因此采用适当方法纯化不饱和脂肪酸对开发柞蚕蛹油保健品至关重要。本文采用尿素包合法纯化东北柞蚕蛹油中的不饱和脂肪酸并利用正交设计法考察包合工艺，以提高蛹油中不饱和脂肪酸的含量，为进一步开发东北柞蚕蛹不饱和脂肪酸保健品奠定纯化工艺基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验试剂与仪器 81-A-36型培养干燥两用恒温箱（吉林农安医疗器械厂）；JS-06S电子计数天平（成都普瑞逊电子有限公司）；Spe-ed SFE-2超临界萃取仪（美国ASI公司）；ETS-D5磁力搅拌器（德国IKA）；RE201-D旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）；7890-气象色谱仪（美国安捷伦公司）。

高纯CO2（长春巨洋气体）；氢氧化钠、氢氧化钾、无水硫酸钠、95%乙醇、浓盐酸、正己烷均为分析纯。原料为市售新鲜东北柞蚕蛹。

1.2 东北柞蚕蛹的预处理 称取市售新鲜东北柞蚕蛹，置家用捣碎机中捣碎，将捣碎物置干燥箱中恒温60℃烘干，得干蚕蛹粉备用。

1.3 柞蚕蛹油的萃取方法 本文采用超临界CO2流体萃取法提取蛹油。称量粉碎后的干柞蚕蛹粉50.0 g置于300 mL萃取釜中。分别设置炉温（OVEN）和出口阀（VALVE）温度（80℃），待温度到达45℃以后，将萃取釜连接于箱内，夹上温度传感器。通入二氧化碳，打开排放阀排出萃取釜内残存的少量空气，关闭排放阀。打开增压泵，将萃取压力调至50Mpa。打开排放阀开始萃取收集，收集时间为6 h。放空流速由浮子流量计测量，放空速度保持在5 L／min左右。萃取结束后根据所得柞蚕蛹油的质量计算萃取率μ，μ＝柞蚕蛹油质量（g）／干柞蚕蛹粉质量（g）×100%。

1.4 柞蚕蛹油混合脂肪酸的制备 称取25 g柞蚕蛹油置500mL具塞烧瓶中，加入3.7%NaOH乙醇溶液125mL，65℃水浴中搅拌（1000 r／min）1 h，静置至室温，加蒸馏水至溶液澄清透明，用盐酸调pH 2～3，于分液漏斗中用正己烷100mL萃取，弃水层，水洗油层至中性。油层经无水硫酸钠脱水后于40℃水浴旋转蒸发至无溶剂蒸出，既得混合脂肪酸。平行操作3次，以重量计混合脂肪酸提取率μ，μ＝总脂肪酸质量（g）／柞蚕蛹油质量（g）×100%。

1.5 柞蚕蛹油的气相色谱分析 气相色谱分析条件为：气相色谱柱：HP-88型毛细管柱（100m×0.25mm×0.20μm，安捷伦）。进样口250℃，检测器260℃，进样量1μL，流量1 mL／min，分流进样，分流比20∶1，FID检测器。程序升温：100℃保持5min，10℃／min到175℃，保持10min，5℃／min到210℃，保持5min，5℃／min到250℃，保持10min。

脂肪酸甲酯化方法：取油2～3滴，加入2mL正己烷，混合均匀，加入1mL 2mol／L KOH-甲醇溶液，混合后，暗处静置10min，中间取出混合一次，取上层过滤膜进样。

1.6 正交设计法考察尿素包合法纯化不饱和脂肪酸的工艺 选取脂肪酸-尿素（A）、脂肪酸-甲醇比（B）、包合温度（C）和包合时间（D）4个因素进行工艺考察，以不饱和脂肪酸的纯度为考察标准，采用四因素三水平的正交试验L9（34），优化尿素包合法分离纯化东北柞蚕蛹油中不饱和脂肪酸的最佳工艺条件，正交因素及其水平如下（见表1）。

表1 正交因素水平表Tab.1 Orthogonal table of factors and levels

尿素包合法纯化不饱和脂肪酸的具体方法为：按照考察因素脂肪酸-尿素（w／w，A）和脂肪酸-甲醇（w／v，B），先将尿素加入甲醇中，65℃水浴中搅拌使溶解，再加入相应比例的脂肪酸，搅拌30 min，冷却至室温，设定包合温度为C（℃），时间为D（h）。取出后迅速减压抽滤，用少量甲醇洗结晶，滤液用盐酸调至pH 2～3，转移至分液漏斗中用120mL正己烷分3次萃取，弃水层，水洗油层至中性，油层用无水硫酸钠脱水后，于40℃水浴中旋转蒸发至无溶剂馏出，即得纯化产物。

2 结果

2.1 SFE-CO2萃取柞蚕蛹油及混合脂肪酸制备 SFE-CO2萃取法从东北柞蚕蛹干粉中萃取柞蚕蛹油的萃取率为17.93%，RSD%为1.7%（n＝3）。根据本文1.4项下方法制备混合脂肪酸，以重量计算收率，柞蚕蛹油混合脂肪酸平均提取率为91.41%，RSD%为1.55%（n＝3）。

2.2 混合脂肪酸的成分分析 根据本文1.5项下的气相色谱使用条件及方法，采用面积归一化法，分析得到东北柞蚕蛹油混合脂肪酸的主要成分及含量为：碳十五烷酸37.03%，棕榈酸5.63%，碳十七烷酸32.81%，硬脂酸1.79%，油酸3.75%，亚油酸11.98%，α-亚麻酸7%，不饱和脂肪酸的含量占混合脂肪酸比例为22.73%，气相色谱图如下（见图1）。

图1 柞蚕蛹油混合脂肪酸气相色谱图Fig.1 GC chromatogram ofmixed fatty acid

2.3 尿素包合工艺的正交试验结果 根据正交设计试验结果分析，对脂肪酸纯度影响的主次顺序为B＞C＞D＞A，即脂肪酸-甲醇比影响最大，脂肪酸-尿素比影响最小，正交设计结果如下（见表2）。以不饱和脂肪酸纯度为评价指标，最佳工艺条件确定为A2B3C2D2，即脂肪酸-尿素-甲醇（1∶3∶10），包合温度－10℃，包合时间为18 h。采用该条件进行纯化后，不饱和脂肪酸纯度为84.08%，RSD＝1.72%（n＝3）。经相同条件进行二次包合后，不饱和脂肪酸纯度可达95.70%，RSD＝1.84%（n＝3），二次纯化后碳十五烷酸与硬脂酸均已检测不到，而碳十七烷酸与棕榈酸含量也明显下降，纯化后气相色谱图如下（见图2）。

表2 纯化不饱和脂肪酸正交设计试验结果Tab.2 Results of orthogonal test of purifying the unsaturated fatty acids

图2 柞蚕蛹油纯化后脂肪酸混气相色谱图Fig.2 GC chromatogram of purified fatty acid

3 讨论

我国东北地区具有极其丰富的柞蚕资源，但目前对如此巨大的绿色生物资源的开发利用却相对落后而造成浪费。因此，亟需采用现代化科技手段对东北柞蚕蛹的保健功能进行开发，以实现其潜力巨大的经济效益和社会效益。

柞蚕蛹油中不饱和脂肪酸的纯化对于柞蚕蛹油保健品的开发至关重要，目前不饱和脂肪酸的分离方法主要有精馏法、色谱法、尿素包合法、络合法等［4-5］。本文采用尿素包合法纯化柞蚕蛹油中的不饱和脂肪酸。尿素包合法纯化不饱和脂肪酸的原理是当尿素溶解于有机溶剂中，遇脂肪族化合物，尿素分子之间以氢键结合成六面体结构，饱和脂肪酸直径小于尿素框架的自由空间，在结晶过程中饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸就能够进入管道内，被尿素包合于六面体结构中，形成尿素包合物而析出，而多不饱和脂肪酸由于双键较多而具有一定的空间构象，不易被尿素包合，由此采用过滤方法可将饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸分开。该方法的优点在于操作简单，对设备要求低。成本较低，所需试剂价格低廉，且尿素能够回收重复利用。而尿素包合法最突出的优点是该法不在高温下进行操作，因此能有效地保护双键，防止氧化［6-7］。

本文对尿素包合法纯化东北柞蚕蛹不饱和脂肪酸的工艺进行了考察，确定了纯化的最优工艺，通过2次包合使不饱和脂肪酸的纯度得到了极大的提高，为进一步开发东北柞蚕蛹油产品提供了纯化研究基础。

［1］王茜，王学英，王卓，等.柞蚕蛹油和不饱和脂肪酸制品的组分分析及对高血脂症的防治作用［J］.蚕业科学，2009，35（2）：436-440.

［2］倪红，陈怀新，杨艳燕.柞蚕蛹综合利用技术［J］.湖北大学学报（自然科学版），2003，25（3）：263-266.

［3］封槐松，李建琴.东北柞蚕生产现状问题与对策［J］.中国蚕业，2011（4）：1-5.

［4］张桂梅，何美莹，姜士宽，等.多不饱和脂肪酸的富集纯化方法及研究进展［J］.热带农业科技，2008，31（4）：48-53.

［5］徐文晖，王俊儒，梁宗锁.不饱和脂肪酸分离技术研究概况［J］.食品研究与开发，2007，28（8）：153-156.

［6］蒋艳忠.蚕蛹油多不饱和脂肪酸的尿素包合分离研究［J］.食品工业，2013，34（5）：29-31.

［7］宋燕青，邓树海，张四喜，等.蚕蛹油中α-亚麻酸的尿素包合法纯化与含量测定［J］.中国生化药物杂志，2007，28（5）：330-332.

（编校：吴茜）

Investigation on the purification process of unsaturated fatty acid in Northeast tussah pupa oil w ith themethod of urea adduction fractionation

QU Xiao-yu，ZHANG Si-xi，ZHOU Li-ting，SONG Yan-qingΔ

（Department of Pharmacy，The First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China）

ObjectiveTo investigate the purification process of unsaturated fatty acid in Northeast tussah pupa oil with the method of urea adduction fractionation.MethodsThe oil from the Northeast tussah pupa powder was extracted with super critical fluid extraction technology-CO2（SFECO2）.The unsaturated fatty acid was purified with urea adduction fractionation method and the best purification processwas investigated with orthogonal testmethod.The composition of the oilwas detected by gas chromatography（GC）.ResultsThe extracting rate of the oil from the Northeast tussah pupa powderwas 17.93%（w／w），and the percent of unsaturated fatty acid were 22.73%in the mixed fatty acid.The best adduction conditions were obtained：the ration of fatty acid-urea-methanol（1∶3∶10，w／w／v），adduction temperature at－10℃and adduction time at18 hours.The percentof unsaturated fatty acid was 84.08%after first time adduction and 95.70%after second time adduction.Conclusion The method of urea adduction fractionation is compatible with the advantages such as simple operation and low cost.This method is reliable to further develop the products of unsaturated fatty acid from Northeast tussah pupa oil.

urea adduction fractionation；Northeast tussah pupa；purification；unsaturated fatty acid；gas chromatography（GC）

TQ645.1

A

1005－1678（2014）08－0167－03

吉林省中医药管理局科技课题资助项目（3D513M623428）

曲晓宇，男，硕士，药师，研究方向：药物制剂学，E-mail：quxiaoyuhaha＠163.com；宋燕青，通信作者，女，博士，主管药师，研究方向：医院药学，E-mail：59137154＠qq.com。