孕酮对妊娠期女性CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞的影响研究

刘新贵，赵凤亭，孙莹璞，胡琳莉

（1.郑州大学第一附属医院生殖中心，河南郑州450052；2.郑州大学第一附属医院检验科，河南郑州450052）

孕酮对妊娠期女性CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞的影响研究

刘新贵1，赵凤亭2，孙莹璞1，胡琳莉1

（1.郑州大学第一附属医院生殖中心，河南郑州450052；2.郑州大学第一附属医院检验科，河南郑州450052）

目的探讨孕酮对妊娠期女性外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞水平的影响。方法选取郑州大学第一附属医院妇产科收治的先兆流产妊娠患者20例，为先兆流产组，孕酮注射液20mg，肌肉注射，1天1次，连续治疗5 d；另选取本院行正常妊娠检查的妊娠患者20例，为正常妊娠组；以及行体检正常未孕者20例，为正常未孕组。分别于晨起空腹抽取3组患者静脉血，采用放射免疫发光法检测3组血清孕酮水平；用流式细胞检测方法检测外周血单个核细胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例；采用RT-PCR技术检测单个核细胞中Foxp3 mRNA表达。结果治疗前，正常妊娠组和先兆流产组血清孕酮水平、调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例和单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平均显著高于正常未孕组，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常妊娠组孕酮水平、调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例和单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平显著高于先兆流产组水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。先兆流产组患者予以黄体酮注射液治疗结束后，外周血中血清孕酮水平、调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例和Foxp3 mRNA表达水平均显著高于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论外周血孕酮与CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞水平呈正相关，先兆流产患者外周血孕酮和CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞水平均低于正常妊娠患者，提示这些调节性T细胞能够维持人类正常妊娠，防止流产，对临床具有指导意义。

孕酮；妊娠；CD4＋CD25＋Foxp3＋；调节性T细胞

先兆流产是指妊娠28周前出现阴道少量流血，伴有下腹部疼痛或者腰部疼痛症状，子宫颈口未开，无妊娠物排出，若不及时治疗，将发展为难免流产［1］。先兆流产早期症状不典型，临床上无法预测先兆流产的发生，容易误诊，导致不良妊娠结局［2-3］。现代医学多采取精神支持治疗和激素治疗等疗法。研究发现［4］，母体和胚胎的免疫耐受在正常妊娠中起到重要作用，当免疫耐受出现障碍时，将会导致妊娠失败，其中调节性T细胞是母体-胚胎免疫耐受的重要调节因子，调节性T细胞的发育和功能维持与转录因子Foxp3和孕酮的关系密切。本研究旨在通过观察孕酮水平与外周血单个核细胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例及单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平，来探究孕酮对妊娠期女性外周血CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞水平的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年1月～2013年12月来郑州大学第一附属医院行先兆流产治疗妊娠患者20例，平均年龄（26.14±7.61）岁；来本院行正常妊娠检查的妊娠患者20例，平均年龄（25.52±6.78）岁；以及来本院行体检正常未孕者20例，平均年龄（27.68±8.16）岁。3组研究对象的一般资料相仿，差异无统计学意义。

1.2 诊断标准 先兆流产［5］：①有明显停经史；②妊娠时间不到28周；③阴道有少量出血，伴有下腹部轻度疼痛或者腰背痛；④妇查：宫口未开，无妊娠物排出，子宫大小与停经时间相符；⑤彩超可见妊娠囊，但迟迟未见胎心出现；⑥每48 h人体绒毛促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）水平升高不到65%。

正常妊娠［6］：①有明显停经史；②阴道无异常流血，无腹痛或腰痛，无其他不适症状；③彩超可见妊娠囊、胎儿及胎；子宫大小与停经时间相符；④血HCG水平有倍增时间。

1.3 纳入标准 符合先兆流产和正常妊娠的诊断标准；年龄19～36岁；妊娠时间小于28周；患者自愿参与本实验，并签署知情同意书；经所在单位伦理学相关机构的批准。

1.4 排除标准 心、肝、胆严重疾病；恶性肿瘤；自身免疫性疾病；糖尿病；高血压；有不良孕产史；患有病毒性肝炎等传染病患者；神志异常以及近2个月来服用增强免疫力的药物的患者。

1.5 治疗方法 先兆流产组确诊为先兆流产后，予以黄体酮注射液（浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H33020828）20mg，肌肉注射，1天1次，连续治疗5 d。

1.6 观察指标及检测方法 各组实验研究对象于晨起空腹抽取静脉血2 mL，加入含EDTA-K2抗凝剂的真空管中混匀，离心分离血清，立刻检测，采用放射免疫发光法检测3组患者血清孕酮水平。按照稀释、单个核细胞分离、纯化、洗涤、重悬、细胞计数及活性的判定和调整浓度的步骤制备单个核细胞悬液，采用流式细胞计数检测调节性T细胞占CD4＋T细胞的百分比。取单个核细胞悬液100μL行RNA提取，逆转录，PCR扩增产物相对定量分析，通过成像分析scion软件计算和比较单个核细胞中Foxp3产物条带的吸光度值，并与β-actin条带光密度值比较，计算出单个核细胞中Foxp3在人外周血中mRNA表达含量。

1.7 统计学方法 采用统计学软件SPSS17.0进行统计学分析，正态计量资料用“±s”表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前3组患者外周血清孕酮水平及调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例比较 正常妊娠组和先兆流产组外周血清孕酮水平均显著高于正常未孕组，差异有统计学意义（P＜0.05），而正常妊娠组外周血清孕酮水平显著高于先兆流产组水平，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常妊娠组和先兆流产组外周血单个核细胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例均显著高于正常未孕组，差异有统计学意义（P＜0.05），而先兆流产组外周血单个核细胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例显著低于正常妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.05，如表1）。

表1 3组患者血清孕酮水平以及调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例比较情况Tab.1 Comparison of serum progesterone levels and proportion of regulatory T cells accounting for CD4＋T cell in three groups

2.2 治疗前3组外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平比较 RT-PCR结果示：正常妊娠组和先兆流产组外周血单个核细胞中Foxp3 mRNA表达水平均高于正常未孕组，差异有统计学意义（P＜0.05）。正常妊娠组、先兆流产组和正常未孕组光密度值分别为（0.807±0.031）、（0.516±0.024）和（0.351± 0.037）；而先兆流产组水平低于正常妊娠组水平，差异有统计学意义（P＜0.05，见图1）。

图1 3组外周血单个核细胞中Foxp3＋mRNA表达水平比较Fig.1 Comparison of Foxp3＋mRNA expression levels in peripheral blood mononuclear cells in three groups

2.3 先兆流产组治疗前后外周血孕酮水平、调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例比较 先兆流产组患者予以黄体酮注射液治疗结束后，外周血中血清孕酮水平和单个核细胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例均显著高于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 治疗前后外周血孕酮水平、调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例比较Tab.2 Comparison of the progesterone levels in peripheral blood，percent of regulatory T cells accounting for CD4＋T cells

2.4 先兆流产组治疗前后外周血单个核细胞中Foxp3＋mRNA表达水平比较 RT-PCR结果示：治疗后外周血单个核细胞中Foxp3＋mRNA表达水平高于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗前和治疗后光密度值分别为（0.516±0.024）和（0.705±0.035）（见图2）。

图2 治疗前后外周血单个核细胞中Foxp3＋mRNA表达水平比较Fig.2 Comparison of Foxp3＋mRNA expression levels in peripheral blood mononuclear cells

3 讨论

在正常妊娠中，母体的内分泌环境、免疫功能以及胚胎等条件都起到非常重要的作用，但是性激素特别是孕酮的作用也不可忽略［7-8］。正常妊娠需要母体能够分泌一定量的孕酮，并能随着孕周的增加而平稳上升，高浓度的孕酮通过对增大的子宫产生镇静作用而支持早期的正常妊娠。研究表明［9-10］，高浓度的孕酮能够降低子宫肌纤维和子宫的敏感性，防止子宫收缩而发生流产，有利于受精卵的正常着床、生长和发育。因此低水平的孕酮，会造成胚胎着床、生长不良，子宫兴奋而产生先兆流产现象［11］。

本实验研究结果显示，先兆流产组治疗前和正常妊娠组的孕酮水平均显著高于正常未孕组，差异有统计学意义（P＜0.05），而正常妊娠组外周血清孕酮水平显著高于先兆流产组水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。这也证实了妊娠女性外周血中孕酮水平高于正常人，并且正常的妊娠需要高浓度的孕酮水平来支持，低水平的孕酮影响正常妊娠，而产生先兆流产［12］。正常妊娠组和先兆流产组治疗前外周血单个核细胞中CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞占CD4＋T细胞的比例以及Foxp3＋mRNA均表达水平显著高于正常未孕组，差异有统计学意义（P＜0.05），而先兆流产组2指标水平均低于正常妊娠组，差异有统计学意义（P＜0.05）；先兆流产组治疗后外周血孕酮水平、调节性T细胞水平和Foxp3mRNA均表达水平显著高于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05），证明妊娠患者外周血中调节行T细胞和转录因子Foxp3 mRNA均表达水平均高于正常未妊娠者；正常的妊娠需要正常的免疫功能调节母体对胚胎免抗原的耐受能力［13］。先兆流产组黄体酮注射液治疗后外周血中调节行T细胞和转录因子Foxp3均显著上升，说明孕酮水平与调节性T细胞和转录因子Foxp3呈正相关，提示孕酮可能是通过调节孕酮受体来提高调节性T细胞和转录因子Foxp3来增强母-胎的免疫耐受能力，以支持正常妊娠［14-15］。

综上所述，高浓度的孕酮水平是维持正常妊娠的必要条件，CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞在维持正常妊娠中也具有重要作用；孕酮也能通过提高CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞增强母-胎免疫耐受［17］，支持正常妊娠，防止先兆流产，减轻患者痛苦，具有重要的临床意义。

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（编校：刘路路，吴茜）

Effect of progesterone on CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells in pregnancy women

LIU Xin-gui1，ZHAO Feng-ting2，SUN Ying-pu1，HU Lin-li1

（1.Reproductive Center，First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2.Department of Inspection，First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China）

ObjectiveTo investigate the impact of progesterone on level of peripheral blood CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells in pregnant women.Methods20 pregnantwomen with threatened abortion admitted in reproductive center of first affiliated hospital of Zhengzhou university were selected as threatened abortion group，20 normal pregnant women were selected as normal pregnant group，and 20 normal unfertilized women were selected as normal unfertilized group.In threatened abortion group，patientswere given 20mg progesterone injection by intramuscular injection，once a day，for 5 days.In the morning，venous blood was drew from patients with an empty stomach in three groups respectively，radiation immune luminescencemethod was used to detect serum progesterone level of three groups；flow cytometry detection methods was used to detect the percent of CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells accounting for CD4＋T cells in peripheral blood mononuclear cells；reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）technology was used to detect expression of Foxp3 mRNA in mononuclear cells.ResultsBefore treatment，serum progesterone levels，the percent of CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells accounting for CD4＋T cells and expression of Foxp3 mRNA inmononuclear cells in normal pregnant group and threatened abortion group were significantly higher than normal unfertilized group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）；Serum progesterone levels，the percent of CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells accounting for CD4＋T cells and expression of Foxp3 mRNA in mononuclear cells in normal pregnant group were significantly higher than threatened abortion group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.After injection of progesterone，Serum progesterone levels in peripheralblood，the percent of CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells accounting for CD4＋T cells and expression of Foxp3 mRNA in mononuclear cells in threatened abortion group were significantly higher than those before treatment，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion There is a positive correlation between serum progesterone levels in peripheral blood and CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells levels.Serum progesterone levels in peripheral blood and CD4＋CD25＋Foxp3＋regulatory T cells levels in threatened abortion group is higher than normal pregnant group，which suggests these regulatory T cells can sustain human normal pregnancy，preventmiscarriage，and guide the clinic.

progesterone；pregnancy；CD4＋CD25＋Foxp3＋；pegulatory T cells

R714.21

A

1005－1678（2014）08－0124－03

NSFC－河南人才培养联合基金（U1304315）

刘新贵，男，硕士，主管技师，研究方向：人类生殖与内分泌或妇科肿瘤相关免疫与分子生物，E-mail：liuxinguidr＠126.com。