SDF-1在牵张成骨中的表达及作用机制研究

周恩瑜，李天泉，李保康，邬玉林，刘亮，屈依丽

（1.四川省甘孜藏族自治州人民医院外四科，四川甘孜626000；2.四川省甘孜藏族自治州人民医院手术室，四川甘孜626000；3.四川大学临床医学系，四川成都610207）

SDF-1在牵张成骨中的表达及作用机制研究

周恩瑜1，李天泉1，李保康2，邬玉林1，刘亮1，屈依丽3

（1.四川省甘孜藏族自治州人民医院外四科，四川甘孜626000；2.四川省甘孜藏族自治州人民医院手术室，四川甘孜626000；3.四川大学临床医学系，四川成都610207）

目的探讨基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）在大鼠下颌骨中牵张成骨（distraction osteogenesis，DO）区的表达情况及其作用机制。方法40只SD大鼠随机分为8组，每组各5只，全部将右侧下颌骨表面皮肤切开，放置下颌骨牵张器，调整塑形并固定。而后将大鼠左侧下颌骨骨折行钛板内固定手术以作对照。随后分别于不同的时间点（0、3、6、9、12、15、18、21 d）将大鼠麻醉处死，解剖大鼠双侧下颌骨后，小心刮取右侧牵张间隙骨痂及左侧骨折处骨痂进行免疫组织化学检测和酶联免疫吸附测定。结果40只大鼠伤口均愈合正常，手术耐受性良好。免疫组化染色结果显示：SDF-1在成骨细胞和微血管周围表达较多，且在DO的新生骨痂中的表达较骨折处骨痂中的表达明显升高。酶联免疫吸附检测结果显示：无论在DO区或是骨折区，SDF-1术后3 d的表达量增加了3倍，术后1周后，SDF-1在骨折区的表达情况呈逐渐下降趋势，在DO区的表达在进入牵张期内其再次上升，高达原有水平的5倍，牵张结束后缓缓下降，SDF-1在2区的表达情况比较分别在9、12、15 d天有统计学差异（P＜0.05）。结论SDF-1在牵张成骨区和骨折区的表达差异明显，为日后研究SDF-1在牵张成骨中的表达及作用机制奠定了理论基础。

牵张成骨；基质细胞衍生因子-1；酶联免疫吸附法

牵张成骨（distraction osteogenesis，DO）是指在截开的骨缝处安置可以施加牵引力的牵张装置来牵张骨段，从而促进骨缝间新生骨组织的形成［1］。近些年随着牵张成骨技术的不断完善，此技术得到了越来越广泛的应用。基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是由骨髓基质细胞及相关上皮细胞分泌的一种趋化蛋白，属于趋化因子家族，在免疫调节［2-4］、炎症反应［5-6］、免疫性疾病［7］、HIV感染［8］、肿瘤细胞的迁移［9-10］等方面均起到了重要作用。国内外当前对SDF-1在牵张成骨中的表达情况研究较少，故本实验将重点研究SDF-1在牵张成骨新生骨痂中的表达情况，并以一般的骨折愈合为对照进行对比性研究，希望对其在DO中的作用机制做出初步分析。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器与试剂 外置式大鼠单侧下颌骨牵张器、匀4孔微型钛板（西安中邦钛生物材料公司），台式离心机-ST16R（德国赛默飞世尔公司），低速离心机LXJ-64-01型（长沙湘仪离心机有限公司），其他手术工具均购自上海康为医疗科技发展有限公司。主要试剂有1%戊巴比妥钠溶液，生理盐水，2%利多卡因注射液，红霉素软膏，注射用青霉素，碘伏溶液。

1.2 单侧下颌骨牵张成骨大鼠模型的构建 雄性Sprague-Dawle大鼠40只，动物许可证号：SCXK（粤）2008-0020，体质量300～350 g，购自四川大学实验动物中心，清洁级，给予正常饲养。本研究经实验动物伦理委员会批准。术前对大鼠进行禁食处理，并注射适当剂量的青霉素。将大鼠麻醉后固定于动物台上，取仰卧位，刮毛，备皮，碘伏消毒。将右侧下颌骨表面皮肤切开，沿骨膜下进行分离，暴露下颌角和下颌骨体，放置下颌骨牵张器，调整塑形使之与下颌骨颊侧完全贴合后，微型螺钉固定。牵张器固定完成后使用庆大霉素反复冲洗创面，逐层缝合并涂抹红霉素软膏。将大鼠左侧下颌骨骨折行钛板内固定手术以作对照。待大鼠完全苏醒后，当日禁食，日后给予软饲料饲养并检测切口，定期消毒。

1.3 大鼠模型分组 将40只大鼠按体质量随机分为8组，每组5只，根据术后大鼠苏醒后处死时间的不同，命名为A组（术后当天取材）、B组（延迟期内，术后3 d）；C组（牵张加力1 d，术后6 d）、D组（牵张加力4 d后，术后9 d）、E组（牵张加力7 d、术后12 d）、F组（牵张加力10 d后，术后15 d）、G组（固定期3 d后，术后18 d）、H组（术固定期6 d后，术后21 d）。取手术区下颌骨松质骨进行检测；取材时沿着骨断端界面处完整地截取右侧牵张间隙骨痂及左侧骨折处骨痂进行检测。

1.4 SDF-1的表达与检测 将所得标本进行甲醛溶液固定24 h后，10%的EDTA脱钙7 d后进行脱水、石蜡包埋，沿牵张方向切得4μm水平切片，将组织切片于室温下与含0.1%胰蛋白酶的PBS共同培养30min；滴加适当稀释的兔抗大鼠SDF-1多克隆抗体50μL，孵育2 h，以含0.05%吐温-20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，滴加生物素标记的羊抗兔二抗孵育30min，以含0.05%吐温-20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次，滴加HRP辣根酶标记链霉卵白素孵育30min，以含0.05%吐温-20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液冲洗3次进行DAB染色，复染，封片进行荧光显微镜观察。

所有标本于4℃下研磨裂解，离心15 min后取上清液进行总蛋白测定。应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定SDF-1的含量，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0对实验数据进行统计学分析，正态计量数据以“±s”表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义；并将酶联免疫吸附结果以时间为横轴，SDF-1的表达相对增高的倍数为纵轴，绘制动态曲线图。

2 结果

2.1 SDF-1在牵张成骨及骨折区内的表达情况 40只实验大鼠伤口愈合正常，手术耐受性良好，在取材日期内均保持正常健康的状态。

免疫组化染色结果显示：SDF-1在成骨细胞和微血管周围表达较多，且在DO的新生骨痂中的表达较骨折处骨痂中的表达明显增多（见图1）。

图1 SDF-1在牵张成骨区与骨折区的表达Fig.1 Expression of SDF-1 in distraction osteogenesis and fracture zone

2.2 SDF-1表达随时间变化趋势 ELISA检测结果显示：无论在DO区或是骨折区，SDF-1术后3 d的表达量增加了3倍，术后1周，SDF-1在骨折区的表达情况呈逐渐下降趋势，在DO区的表达在进入牵张期内再次上升，至原有水平的5倍，牵张结束后缓缓下降，SDF-1在2个区的表达情况比较分别在9、12、15 d差异有统计学意义（P＜0.05，见表1、图2）。

表1 SDF-1在DO区与骨折区的表达比较（μg／L）Tab.1 Expression of SDF-1 in DO and the fracture zone（μg／L）

图2 SDF-1在牵张成骨区与骨折区的表达趋势*P＜0.05，与DO区比较Fig.2 Expression trend of SDF-1 in distraction osteogenesis and fracture zone *P＜0.05，compared with DO zone

3 讨论

随着科技的不断进步，牵张成骨技术的研究也在不断地深化，但考虑到目前牵张成骨技术的复杂性与实验动物的手术耐受性，一般多采用兔、犬等大型动物，但是这些动物的饲养周期长、动物成本高、实验规模小，以上一系列因素严重影响着实验结果的普遍性和广泛性，对研究结果的影响程度较大，故本实验考虑采用SD大鼠作为动物模型。SD大鼠的成本较之兔、犬等低廉，可以在规定的时间内进行大规模的研究取材，且SD大鼠为常见的动物模型，实验员对其的手术操作较为熟练，可在一定程度上降低不必要的损伤与人为误差，从而提高实验的成功率与准确性［11］。加之考虑到SD大鼠骨代谢的规律同人体基本相似，故确定SD大鼠为本次实验研究的动物模型。

在牵张成骨的手术中，对大鼠下颌骨的骨切开线的设计是至关重要的，也是影响着手术成败的关键。有研究报道，将下颌骨骨切开线的位置设定在第2磨牙到第3磨牙之间，从生理学讲，此位置处于下颌体部位，骨切开线两侧的骨质偏厚，对牵张器的固定是极为有利的，但此位置也极易与口腔穿通，从而造成伤口感染，影响实验的准确性致使实验失败［12］。也有研究报道，将骨切开线的位置选定在下颌骨的升支乙状切迹处，该位置距离口腔较远，可在一定程度上避免口腔穿通，从而降低术后感染情况，但实际上下颌骨的升支骨的骨质较薄，无法承受牵张器工作过程中的牵张力，从而造成手术过程中的骨折，术后不易固定以及牵张器在工作中脱落等情况，使得在下颌骨的升支乙状切迹处设置骨切开线也难以实现［13］。本实验在综合分析了前人的研究和尝试后，最后确定将本次实验的骨切开线设定在磨牙后方、下颌升支前缘，经分析可知，该处的骨质具有一定的斜向坡度且具有一定的厚度可以承受手术过程中的压力和牵张力，并为后面螺钉的固定提供了足够的支撑力，该位置也离口腔较远，不易感染与穿通，从而极大降低了术后的感染风险，为术后康复提供了保障。

SDF-1由多种细胞分泌，且表达于人体的多种组织，如心脏、肾脏、大脑、胎盘、卵巢等［14-17］。CXC族细胞因子受体 4（CXCR4）是SDF-1的唯一天然受体，且SDF-1与CXCR4之间的信号通路在维持机体的多项生理功能中具有重要的作用，如介导免疫反应，参与胚胎发育和恶性肿瘤的转移，调控干细胞迁移等。迄今为止，在牵张成骨的研究中，SDF-1的表达及其作用并未被深入研究。

国内外研究表明，在牵张成骨的实验中，牵张期内大鼠体内会分泌各种生长因子，IL-1、IL-6和TNF-α等因子均会呈现上调趋势，这与骨折愈合过程较为相似［18］。本次实验结果显示，牵张成骨的细胞机理及分析作用机理均较为独特。例如DO的骨再生方式主要以膜内成骨为主，而在骨折愈合中主要以软骨成骨为主；在DO间隙内存在大量未矿化的骨质而骨折区内的软骨已矿化成骨；在血管生成时间中也略有不同，DO区一般在牵张开始后就开启血管生成模式而骨折区一般在骨折后的1～2周内，此外，缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）的高水平表达也与牵张成骨密切相关［19］。

综上所述，本实验通过对SDF-1在DO中的表达情况分析，并对其作用机理进行了初步分析；DO的分子生物学机理较为复杂，相信随着对骨形成、修复的不断研究，对其的了解会越来越深入。

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（编校：吴茜）

Study on SDF-1 expression in distraction osteogenesis and its reaction mechanism

ZHOU En-yu1，LITian-quan1，LIBao-kang2，WU Yu-lin1，LIU Liang1，QU Yi-li3

（1.Forth Department of Surgery，People's Hospital of Sichuan Province Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture，Ganzi626000，China；2.Operation Room，People's Hospital of Sichuan Province Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture，Ganzi626000，China；3.Department of Clinical Medicine，Sichuan University，Chengdu 610207，China）

ObjectiveTo explore the expression of stromal cell-derived factor-1 in ratmandibular bone area in distraction osteogenesis and its mechanism of action.Methods40 SD ratswere randomly divided into eight groups，each had five rats，all the surface of skin incision on the rightside ofmandible，mandibular distractor placement，adjust shaping and fixed.The lower left side of the ratmandibular fractures after internal fixation with a titanium plate as controls.Subsequently，ratswere sacrificed at different time points（0，3，6，9，12，15，18，21 d），dissected rat bilateralmandible，carefully scraping the callus from the right side of the distraction gap and left side of the fracture zone for chemical tests and enzyme-linked immunosorbent assay immunohistochemistry.Results40 rats were all in normal wound healing with good operation tolerance；Immunohistochemical staining showed that，the expression of SDF-1 in osteogenic cells and capillaries around were increased，and its expression in DO freshmen zonewasmore than fracture zone；ELISA test results showed：the expression of SDF-1 at3 days after operation were increased triple both in DO zone and fracture zone. And one week after surgery，SDF-1 expression in the fracture zone was decreased，and in DO zone rising again before entering the distraction period，up to five times，the differences of SDF-1 expression between two zone at9，12，15 d were all significant（P＜0.05）.Conclusion SDF-1 expression levels were different in distraction bone area and fracture zones，which can lay the foundation for future research of SDF-1 expression in distraction and its mechanism.

distraction osteogenesis；stromal cell-derived factor-1；enzyme-linked immunosorbent assay

R681

A

1005－1678（2014）08－0023－03

博士点基金项目（20090181120049）

周恩瑜，男，本科，主治医师，研究方向：创伤骨科，E-mail：zey13618139364＠163.com。