胃十二指肠疾病易感性与IL-1B-31和TNF-α-1031基因多态性的关系研究

王小永，邵伟斌，孙永强

（1.南通市海门市人民医院普外科，江苏南通226100；2.南通市第一人民医院肝胆外科，江苏南通226100；3.南通市第一人民医院胃肠外科，江苏南通226100）

胃十二指肠疾病易感性与IL-1B-31和TNF-α-1031基因多态性的关系研究

王小永1，邵伟斌2，孙永强3

（1.南通市海门市人民医院普外科，江苏南通226100；2.南通市第一人民医院肝胆外科，江苏南通226100；3.南通市第一人民医院胃肠外科，江苏南通226100）

目的分析胃十二指肠疾病易感性与IL-1B-31和TNF-α-1031基因多态性在人群之间的表达关系，为胃十二指肠疾病的诊断和预防提供新的治疗理念。方法使用等位特异PCR法和PCR-限制性长度片段多态方法检测52例慢性胃炎患者、48例十二指肠溃疡患者、50例胃癌患者与100例健康对照组的IL-1B-31和TNF-α-1031的基因多态性。结果在本次研究中，IL-1B-31和TNF-α-1031位点均存在C／T多态性，有C／C、T／T、C／T 3种基因型，IL-1B-31基因PCR扩增产物可见282 bp的条带，限制性内切酶Alu I切割后，C／C型为282 bp，T／T型为100 bp和182 bp，C／T型为100 bp、182 bp和282 bp，TNF-α-1031基因的PCR扩增产物T／C型是T引物和C引物均可见452 bp的条带，C／C型是加上C引物可见452 bp的条带，而T引物未见条带，T／T型是加上T引物有452 bp的条带，而C引物未见条带；本次实验中的所有基因型及其等位基因的频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。且经χ2检验分析可知，观察组的IL-1B-31基因各基因型频率的分布与对照组无显著性差异。TNF-α-1031基因各基因型的频率与对照组比较，在胃炎伴H.pylori患者中、十二指肠溃疡伴H.pylori感染患者中和胃癌伴H.pylori患者中的频率均具有显著性差异（P＜0.05）；在4组风险性的比较中，携带TNF-α-1031 C／C者发生慢性胃炎的危险性OR＝5.69（95%CI：1.00～33.84），发生十二指肠溃疡的危险性OR＝6.87（95%CI：1.19～40.63），发生胃癌的危险性OR＝5.98（95%CI：1.09～35.36）。经过Spearman等级相关分析，IL-1B-31与慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌的相关系数分别为r1＝0.879，r2＝0.826，r3＝0.901；TNF-α-1031与慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌的相关系数分别为r1＝0.426，r2＝0.328，r3＝0.645。结论 IL-1B-31各基因型与幽门螺杆菌相关性胃十二指肠疾病的发生不存在相互关系。胃炎、十二指肠溃疡的易感性与TNF-α-1031基因型存在相关性。

胃十二指肠疾病；白介素-1-B-31；肿瘤坏死因子-A-1031；基因多态性

幽门螺杆菌（helicobacter pylori，H.pylori）是当前世界上感染率最高的一种病原菌，是引发人类慢性胃炎、十二指肠溃疡的关键致病因子，与胃癌等肿瘤性疾病的发生存在着密切的关系。近些年研究表明［1-2］，幽门螺旋杆菌的致病性与宿主的易感性和感染的环境条件存在相互关系，并且这2种因素已经成为幽门螺旋杆菌致病的关键因素。幽门螺旋杆菌感染后，会引起机体产生局部的细胞免疫反应，如白介素（interleukin，IL）-1、白介素-10及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等大量分泌，从而造成一定程度的胃黏膜损伤，由于以上致炎因子在人群中不同程度的表达导致幽门螺旋杆菌感染后所致的疾病不同，本研究通过对幽门螺旋杆菌感染的慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌患者体内的IL-1B-31和TNF-α-1031的分析，并与各种病情的关系加以对比，为今后幽门螺旋杆菌感染的胃十二指肠相关疾病的诊断和治疗提供新的方案。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2010年1月～2013年1月于海门市人民医院消化内科住院的慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌伴H.pylori阳性者共150例，分为3个观察组，其中慢性胃炎患者52例，女20例（38.46%），男32例（61.54%），年龄为25～58岁，平均年龄为（36.35±6.2）岁；十二指肠溃疡患者48例，女19例（39.58%），男29例（60.42%），年龄为27～60岁，平均年龄（38.02±5.4）岁；胃癌患者50例，女23例（46%），男27例（54%），年龄为26～62岁，平均年龄为（39.11±4.02）岁。观察组所有患者均通过胃镜和组织病理学检查后确诊。同时随机选取来本院进行健康体检的H.pylori阳性者共100例为对照组，女41例（41%），男59例（59%），年龄为24～64岁，平均年龄为（36.02±5.86）岁，对照组经检查均无慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌的病史。采用调查问卷和病历记录的方式收集患者的所有临床资料，采集2组人员的信息前均签订了医院伦理委员会发布的知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂 －20℃冰箱（Thermo公司），PCR扩增仪（Pekirn Elmer公司），水浴箱（上海医用分析仪器厂），高速台式离心机（上海医用分析仪器厂），DYY-8B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂），Synthesis超纯水系统（美国Milipore公司），22331Hamburg基因扩增仪（德国Eppendorf公司），BioSens Sc810凝胶成像仪（上海山富科学仪器有限公司；胃幽门螺杆菌抗体检测试剂盒（重庆顺捷医疗器械有限公司），胃幽门螺杆菌快速检测试纸（广州贝思奇诊断试剂有限公司），Premix Taq PCR试剂盒，DNA片段长度标准50bp DNA，限制性内切酶Alu I，琼脂糖（宝生物工程有限公司产品），三羟甲基氨基甲烷（Tris）（上海生工生物工程公司），EDTA（重庆东方试剂厂），Goldview核酸染料（北京赛百盛基因技术公司），其余试剂均由重庆川东化工公司提供。

1.3 材料 从慢性胃炎、十二指肠溃疡、胃癌和健康体检的H.pylori阳性者体内抽取2mL静脉血，将其中1mL全血置于1.5mL的离心管中，分离出血清分装于1.5mL的离心管中。

1.4 引物寡核苷酸 根据Sugimoto M等［3-4］的研究，使用Primer Premier5.2软件，设计检测IL-1B-31和TNF-α-1031基因多态性的引物，其序列见表1，设计出来的引物由上海英骏生物技术有限公司合成公司负责合成。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 H.pylori阳性的检测 血清H.pylori抗体检测采用金标免疫斑点法，取血清样本30μL，以生理盐水稀释5倍后，严格按照说明书的步骤进行操作，阴性结果为反应孔中只显示红色的横线，阳性结果为反应孔中出现红色的圆斑，若反应孔中既无圆斑又无红色横线出现则说明试剂无效。

胃粘膜的H.pylori感染采用尿素酶法来检测，严格按照说明书的步骤进行操作，并观察试纸在3min之内的颜色，以保证结果的准确度。若待检的胃黏膜组织边缘在1 min内由黄变红则为强阳性，若变化缓慢则为弱阳性，不变色则为阴性。

1.6 细胞因子基因多态性的检测 采集所有受试者的静脉血2mL，参考向喻［5］的研究，使用EDTA-K2抗凝，以改良的碘化钠法提取血清中的白细胞基因组DNA，保存于－20℃的冰箱中，备用。

PCR反应体系包括5 pmoL的引物，10μL Premix Taq（Taq DNA聚合酶，dNTP，Mg2＋），模版DNA 4μL，以超纯水补至总体积为20μL。IL-1B-31和TNF-α-1031的基因检测PCR反应条件见表2。

表2 测定IL-1B-31和TNF-α-1031基因多态性的PCR反应条件Tab.2 PCR reaction conditions of IL-1B-31，and TNF-α-1031 gene polymorphism measure

使用限制性内切酶Alu I对IL-1B-31扩增产物在37℃的水浴箱中进行酶切处理，而后以2%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行分离，而后进行Goldview染色并将DNA条带使用凝胶成像仪观察，记录结果，由于TNF-α-1031引物的特殊性，不可进行酶切分析，故本实验对TNF-α-1031引物采用直接凝胶电泳以观察基因的突变位点。

1.7 统计学方法 采用SPSS17.0对实验数据进行统计学分析，对各基因型及其等位基因频率的计算采用频数计数法，并经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检测研究对象的同一种群度。2组间的基因型频率差异采用χ2检验，各因素间的相关性分析应用Spearman等级相关分析。以P＜0.05表示为差异有统计学意义。以优势比（odds ratio，OR）及95%可信区间（confidence interval，CI）表示各基因型发生H.pylori相关性胃十二指肠疾病的危险性。采用Logistic回归计算优势比值，且在本次实验中的所有统计检验均为双侧概率检验。

2 结果

2.1 PCR扩增产物及酶切产物的鉴定 经2%琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示，IL-1B-31基因PCR扩增产物可见282 bp的条带，限制性内切酶Alu I切割后，C／C型为282 bp，T／T型为100 bp和182 bp，C／T型为100 bp、182 bp和282 bp，TNF-α-1031基因的PCR扩增产物T／C型是T引物和C引物，均可见452 bp的条带，C／C型是加上C引物可见452 bp的条带，而T引物未见条带，T／T型是加上T引物有452 bp的条带，而C引物未见条带，结果见图1。

图1 IL-1B-31基因和TNF-α-1031基因的PCR产物及多态性分析在TNF-α-1031基因的PCR产物中，2、4、6加T引物，3、5、7加C引物Fig.1 IL-1B-31 and TNF-α-1031 gene PCR product and polymorphism analysis in TNF-α-1031 gene PCR amplification product，2，4，6 were combined with T primer，3，5，7 were combined with C primer

2.2 各基因型的分布频率对比 本次实验中的所有基因型及其等位基因的频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。且经χ2检验分析可知，观察组的IL-1B-31基因各基因型频率的分布与对照组无显著性差异。TNF-α-1031基因各基因型的频率与对照组比较，在胃炎伴H.pylori患者中、十二指肠溃疡伴H.pylori感染患者中和胃癌伴H.pylori患者中的频率均具有显著性差异（χ2＝23.148，P＜0.001；χ2＝9.254，P＜0.05；χ2＝9.264，P＜0.05，见表3）。

表3 各基因型在两组中的分布频率对比Tab.3 Comparation of genotype frequencies between two groups

2.3 各基因型发生胃炎、十二指肠溃疡和胃癌的危险性及相关性 将本实验数据进行Logistic回归模型分析，其中以自变量X1代表IL-1B-31基因型（X1＝1为T／T型，X1＝2为C／T型，X1＝3为C／C型），自变量X2代表TNF-α-1031基因型（X1＝1为T／T型，X1＝2为C／T型，X1＝3为C／C型），因变量Y代表患病与否，其中Y＝0为对照，Y＝1为慢性胃炎组，Y＝2为十二指肠溃疡组，Y＝3为胃癌组，分析IL-1B-31基因型与TNF-α-1031基因型发生慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌的危险性并进行Spearman等级相关分析。结果显示，在4组风险性的比较中，携带TNF-α-1031 C／C者发生慢性胃炎的危险性OR＝5.69（95%CI： 1.00～33.84），发生十二指肠溃疡的危险性OR＝6.87（95% CI：1.19～40.63），发生胃癌的危险性OR＝5.98（95%CI：1.09～35.36），结果见表4；经过Spearman等级相关分析，IL-1B-31与慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌的相关系数分别为r1＝0.879，r2＝0.826，r3＝0.901；TNF-α-1031与慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌的相关系数分别为r4＝0.426，r5＝0.328，r6＝0.645。说明IL-1B-31各基因型与幽门螺杆菌相关性胃十二指肠疾病的发生不存在相互关系。胃炎、十二指肠溃疡的易感性与TNF-α-1031基因型存在相关性。

表4 各基因型发生胃炎、十二指肠溃疡和胃癌的危险性Tab.4 Risk comparison of each genotype occurred gastritis，duodenal and gastric cancer

3 讨论

在中国恶性肿瘤疾病普查中，胃癌的发病率和死亡率占同类疾病的首位［6-7］。胃癌作为一种恶性疾病，其主要发病原因与其遗传基因的易感性密不可分，而其遗传基因的易感性中，细胞因子的多样性占主要地位［8-9］。通过诱导胃黏膜炎性反应中的大量炎性因子，刺激胃酸的特异性分泌，加速对胃黏膜损伤的破坏程度，从而诱导多种疾病的发生［10-12］。

近些年研究显示［13］，国内外对IL-1B-31基因多态性与幽门螺旋杆菌感染慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌等结果各不相同。在本次研究中，IL-1B-31各基因型与幽门螺杆菌相关性胃十二指肠疾病的发生不存在相互关系，此结果与叶荻庆［14］和Mitsushige Sugimoto［15］的研究结果相一致，但与Hamajima N等［16］日本学者的研究不大一致。后来有人发现，IL-10-819TT和IL-1B-31携带者发生幽门螺旋杆菌感染的慢性胃炎和十二指肠溃疡的几率较亚洲其他地方的人均患病率偏高，这就间接表明，IL-1B-31各基因型与幽门螺杆菌相关性胃十二指肠疾病的相关性存在地域性差异，但这并不影响本次结果在今后的研究中的作用和意义。

在本次实验各基因频率分布的对比中，观察组的IL-1B-31基因各基因型频率的分布与对照组无显著性差异。TNF-α-1031基因各基因型的频率与对照组比较，在胃炎伴H.pylori患者中、十二指肠溃疡伴H.pylori感染患者中和胃癌伴H.pylori患者中的频率均具有显著性差异（P＜0.001，P＜0.05），这与张新宪等［17］研究结果相一致，这就提示了慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌携带TNF-α-1031 C／C基因的频率显著增加，可能是因为携带TNF-α-1031C／C基因型的患者在抗炎过程中其TNF-α的表达程度较高，加剧了其在胃黏膜中的破坏作用，从而增加了其各类疾病的发生率。也就说明了TNF-α-1031 C／C基因是幽门螺旋杆菌感染的慢性胃炎、十二指肠溃疡和胃癌的易感因子。

［1］苏善平.IL-1B-31、IL-10-819和TNF-A-1031基因多态性与胃十二指肠疾病易感性的关系探讨［D］.重庆：重庆医科大学.2010.

［2］张军喜.IL-1、TNF基因多态性与幽门螺杆菌感染致胃癌的关系研究［D］.河南：郑州大学.2007.

［3］Sugimoto M，Furuta T，Shirai N，et al.Effects of interleukin-10 gene polymorphism on the development of gastric cancer and peptic ulcer in Japanese subjects［J］.Gastroenterol Hepatol，2007，22（9）：1443-1449.

［4］Sugimoto M，Furuta T，Shirai N，et al.Different effects of polymorphisms of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 beta on development of peptic ulcer and gastric cancer［J］.Gastroe-Nterol Hepatol，2007，22（1）：51-59.

［5］向瑜.IL-1和TNF-Α基因多态性与幽门螺杆菌相关性胃十二指肠疾病关系的探讨［D］.重庆：重庆医科大学.2009.

［6］张云霞，王郁杰，朱莹.幽门螺旋杆菌感染与胃癌相关性探讨［J］.中华医院感染性杂志，2014，24（7）：1700-1704.

［7］田磊，肖秀英，叶明.胃癌分子靶向药物治疗的研究进展［J］. 2014，22（6）：773-781.

［8］张琦，徐智，陈锦飞.胃癌药物治疗进展［J］.癌症进展，2014，12（1）：22-28.

［9］王冬青，丁西平，殷 实.促炎细胞因子在胃癌前病变中的作用［J］.世界华人消化杂志，2014，22（1）：39-45.

［10］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer JClin，2011，61：69-90.

［11］Tsujimoto H，Ono S，Ichikura T，et al.Roles of inflammatory cytokines in the progression of gastric cancer：friends or foes？［J］. Gastric Cancer，2010，13：212-221.

［12］Putoczki TL，Thiem S，Loving A，et al.Interleukin-11 is the dominant IL-6 family cytokine during gastrointestinal tumorigenesis and can be targeted therapeutically［J］.Cancer Cell，2013，24：257-271.

［13］Fehlings M，Drobbe L，Moos V，et al.Comparative analysis of the interaction of Helicobacter pylori with human dendritic cells，macrophages，and monocytes.［J］.Infect Immun，2012，80：2724-2734.

［14］叶荻庆，向瑜，张莉萍，等.IL-1基因多态性与幽门螺杆菌相关性胃十二指肠疾病的关系［J］.重庆医学，2010，39（24）：3375-3377.

［15］Sugimoto M，Shirai N，Nishino M，etal.Comparison of acid inhibition with standard dosagesof proton pump inhibitors in relation to CYP2C19 genotype in Japanese［J］.European Journal of Clinical Pharmacology，2014，17：1713.

［16］Hamajima N，Katsuda N，Matsuo K，et al.High Anti-Helicobacter pylori Antibody Seropositivity Associated with the Combination of IL-1and IL-10-819TT［J］.Genotypes Helicobacter，2013，8（2）：105-110.

［17］张新宪，汪枝梅.原发性十二指肠胃反流程度与胃部炎性反应关系的研究［J］.胃肠病学和肝病学杂志，2013，22（7）：664-666.

（编校：谭玲，秦晓英）

Study on the relationship between gastroduodenal disease susceptibility and IL-1B-31 and TNF-α-1031 gene polymorphism

WANG Xiao-yong1，SHAOWei-bin2，SUN Yong-qiang3

（1.Department of General Surgery，Haimen People's Hospital，Nantong 226100，China；2.Department of Hepatobiliary Surgery，Nantong First People's Hospital，Nantong 226100，China；3.Department of Gastrointestinal Surgery，Nantong First People's Hospital，Nantong 226100，China）

ObjectiveTo analyze the relationship between gastroduodenal diseases susceptibility and IL-1B-31 and TNF-α-1031 gene polymorphism between people，provide a new treatment concept for diagnosis and prevention of gastroduodenal diseases.Methods52 cases of chronic gastritis，48 cases of duodenalulcer，50 cases of gastric cancer patients and 100 cases ofhealthy population were detected on IL-1B-31 and TNF-α-1031 gene polymorphism by allele-specific PCR and PCR-restriction fragment length polymorphism method.ResultsThe results showed that there were C／T polymorphisms in IL-1B-31 and TNF-α-1031 sites，included C／C，T／T，C／T three genotypes，282 bp band was found in IL-1B-31 gene PCR amplification product and cleavaged by restriction endonuclease Alu I，the C／C type turned to 282 bp，T／T type turned to 100 bp and 182 bp，C／T type turned to 100 bp，182 bp and 282 bp，452 bp was found in TNF-α-1031 gene PCR amplification product T／C type，which were T primer and C primer，452 bp was found in C／C type coupled with C-type primer，while band was not found in T-type primer，452 bp band was found in T／T type coupled with T-type primer，while band was not found in C-type；In this experiment，all genotypes and allele frequencies conformed to Hardy-Weinberg genetic equilibrium.Byχ2test and analysis，there was no significant difference of IL-1B-31 gene genotype frequencies distribution in observation group compared with control group.Compared with the control group，TNF-α-1031 genotype frequencies in gastritis patients with H.pylori，duodenal ulcer patients with H.pylori fection and gastric cancer patients with H.pyloriwere significant differences（P＜0.05）；In the four groups of risk comparison，the risk ofpatients with TNF-α-1031 C／C occurred chronic gastritis OR＝5.69（95%CI：1.00～33.84），the risk of the occurrence of duodenal ulcer OR＝6.87（95%CI：1.19～40.63），the risk of gastric cancer OR＝5.98（95%CI：1.09～35.36）.By Spearman rank correlation analysis，correlation coefficients of IL-1B-31 and chronic gastritis，duodenal ulcers and gastric cancerwere r1＝0.879，r2＝0.826，r3＝0.901；the correlation coefficients of TNF-α-1031 and chronic gastritis，duodenal ulcer and gastric cancer were r1＝0.426，r2＝0.328，r3＝0.645．Conclusion There is no correlation between the IL-1B-31 genotype and Helicobacter pylori-related gastroduodenal diseases，Gastritis，duodenal ulcer susceptibility and TNF-α-1031 genotype exist relationship.

gastroduodenal diseases；interleukin-1-B-31；tumor necrosis factor-A-1031；gene polymorphism

R972

A

1005－1678（2014）08－0106－04

王小永，男，本科，副主任医师，研究方向：腹腔镜胆道，E-mail：wxy13862850099＠163.com。