淋巴管密度与鼻咽癌淋巴结转移的关系

邓 恋 刘陶文 屈元姣 曹轶林 陈 熙 彭丽芳

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是1种常见的头颈部恶性肿瘤，初诊时发现颈部淋巴结转移者达75%以上[1-2]。淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)是评估肿瘤淋巴管生成的重要指标。已观察到实体瘤瘤组织周围淋巴管与瘤内淋巴管的分布存在差异，尤其是瘤周淋巴管与肿瘤发生淋巴结转移及患者预后有关[3-4]。但是，关于鼻咽癌淋巴管密度与淋巴结转移关系的研究较少，其临床意义有待明确。本研究应用淋巴管内皮细胞高度特异性和敏感性标记物单克隆抗体D2-40标记鼻咽低分化鳞状细胞癌组织中的淋巴管，以探讨LVD与鼻咽癌患者淋巴结转移的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料

2011年10月至2012年10月，广西壮族自治区南溪山医院肿瘤科收治的、并经病理检查确诊为鼻咽癌患者66例，均为低分化鳞状细胞癌，具有完整的相关临床病理资料；患者均为初治且取组织标本前未接受放化疗；排除存在明显炎症、坏死及严重出血的组织标本。其中男性51例，女性15例，中位年龄48.5岁(19～77岁)。按照我国鼻咽癌2008分期(福州2008分期)标准分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期6例，Ⅲ期26例，Ⅳa期27例，Ⅳb期6例，其中T1期2例，T2期11例，T3期31例，T4期22例；N0期11例，N1a期6例，N1b期12例，N2期22例，N3期15例；M0期60例，M1期6例。对照组：30例同期就诊于该院，并经病理检查确诊为轻度鼻咽黏膜炎的鼻咽组织，其中男性18例，女性12例，中位年龄49.5岁(16～78岁)。

1.2 试剂及方法

即用型免疫组化EliVisionTM super 试剂盒(鼠/兔)、商品化即用型D2-40鼠抗人单克隆抗体、DAB显色试剂盒均购自于福州迈新生物技术开发有限公司。石蜡标本经2 μm连续切片，采用免疫组化Elivison二步法，严格按照说明书进行染色。阴性对照组用PBS液代替一抗，以已知阳性反应片作为阳性对照。

1.3 结果判断

D2-40免疫组化染色以细胞胞质或胞膜呈黄色或棕黄色颗粒为阳性，LVD计数采用Weidner等[5]报道的方法，以D2-40染色阳性的单层扁平上皮且管腔内无红细胞聚集的脉管视为淋巴管，D2-40染色阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇同样视为1个淋巴管。瘤周区域为癌细胞团块周围2 mm范围以内的组织区域。先在低倍镜下(10×)分别找到瘤内及瘤周区域阳性脉管的集中区，即“热点”，再在高倍镜下(200×)计数3个视野的淋巴管数量，然后取均值即为LVD。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 鼻咽癌淋巴管的形态特征及分布

鼻咽癌组织D2-40免疫组化染色阳性的淋巴管管腔形状和大小不规则。轻度鼻咽黏膜炎组织D2-40标记的淋巴管散在分布，其淋巴管管腔形状及大小规则。鼻咽癌组织LVD高于对照组，差异有统计学意义(P=0.033)(表1)。

表1 鼻咽癌组织与对照组LVD的比较

鼻咽癌组织中D2-40免疫组化染色阳性的淋巴管主要分布于肿瘤组织周围，尤其是癌组织与正常组织的交界处。瘤周淋巴管管腔呈扩张状态。瘤内淋巴管分布较少或缺如，多呈塌陷或闭塞状态。66例鼻咽癌组织中瘤周LVD明显高于瘤内LVD，差异有显著性意义(P<0.01)(表2)。

表2 鼻咽癌组织中瘤周LVD与瘤内LVD的比较

2.2 LVD与鼻咽癌组织临床病理特征的关系

鼻咽癌淋巴结转移者瘤周LVD大于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P<0.05)；不同年龄、性别、远处转移、临床分期及T分期的瘤周LVD比较，差异无统计学意义(P>0.05)；年龄<49岁的鼻咽癌患者与年龄≥49岁的患者瘤内LVD比较有统计学意义(P<0.05)；不同性别、T分期、N分期、M分期及临床分期的瘤内LVD比较无统计学意义(P>0.05)(表3)。

2.3 LVD与鼻咽癌淋巴结转移的关系

鼻咽癌瘤周LVD与其N分期有关，N分期越高，瘤周LVD越大(P<0.05)，瘤内LVD与N分期无明显相关性(P>0.05)(表4)。

3 讨论

近年研究证实肿瘤组织中存在淋巴管的新生，淋巴管密度是评估肿瘤淋巴管生成的重要指标[6]。有学者报道胰腺癌、上尿路移行细胞癌组织存在淋巴管生成，并认为瘤周淋巴管为功能性淋巴管，瘤内淋巴管为非功能性淋巴管[3-4]。肿瘤细胞可能通过高表达某些促淋巴管生成因子，如VEGF-C诱导肿瘤组织淋巴管的生成，从而对肿瘤的生长、发展及转移提供基础[7]。而且，Shi等[8]通过对大鼠胰腺癌原位移植模型静脉注射或瘤内注射ShRNA靶向阻断VEGF-C结合通路，并应用RT-qPCR和ELISA检测肿瘤组织对VEGF-C的表达，而且借助D2-40、CD31免疫组化标记肿瘤组织中的淋巴管和血管，发现VEGF-C ShRNA可明显移植肿瘤生长和下调VEGF-C mRNA表达，造成肿瘤组织微淋巴管密度减少。

表3 鼻咽癌淋巴管密度与其临床病理特征的关系

表4 瘤周LVD及瘤内LVD与鼻咽癌淋巴结转移的关系

本实验研究结果显示NPC组织LVD显著高于轻度鼻咽黏膜炎的鼻咽组织，这说明鼻咽癌组织存在淋巴管的新生。本组鼻咽癌瘤周LVD明显高于瘤内，迄今认为其机制是肿瘤组织分泌大量的促淋巴管新生分子。而且，瘤周淋巴管呈开放状态，而瘤内淋巴管常呈闭塞或塌陷状态，这与冯正虎等[9]的研究结果一致。推测肿瘤组织周围区域的淋巴管为功能性淋巴管，这有利于肿瘤细胞转移。本研究尚观察到存在淋巴结转移的鼻咽癌瘤周LVD明显高于无淋巴结转移者，尤其是瘤周LVD与鼻咽癌患者N分期升高呈一致性，此可能有助于为鼻咽癌淋巴结转移提供病理生理学基础，其主要机制是瘤周LVD的增加使肿瘤细胞与淋巴管接触面积增大，导致瘤细胞更易于进入淋巴管和向区域淋巴结转移。近来，Bolenz等[10]应用D2-40和CD34双重免疫组化染色65例上尿路移行细胞癌组织，结果显示瘤周LVD分别高于瘤内LVD及周围正常组织的LVD，该学者认为瘤周淋巴管在肿瘤淋巴道转移过程中为功能性淋巴管，而瘤周LVD可作为判断上尿路移行细胞癌预后的指标之一。同时，学者们观察到存在淋巴结转移的口腔鳞癌、输尿管癌组织LVD显著高于无淋巴结转移组，LVD与临床病理特征如肿瘤大小、类型、分级及淋巴管侵犯无明显关系[11-12]。

然而，也有一些结果与上述不一致。例如，Ozardili等[13]观察到瘤内LVD与肾癌的远处转移及淋巴结转移密切相关，但是与该肿瘤的分级、分期及淋巴管的侵犯无明显关系。另有报道宫颈鳞癌、直肠癌中的淋巴管与淋巴结转移无关[14-15]，这可能与肿瘤的发生部位、组织学类型及微环境产生的淋巴管生成因子有关。

本研究提示鼻咽癌组织存在淋巴管新生，尤其是瘤周淋巴管在肿瘤的生长、发展过程起到重要作用。然而淋巴管新生对肿瘤发生淋巴结转移的确切病理机制有待研究。肿瘤组织淋巴管新生的研究有益于开拓肿瘤治疗的新策略，如针对肿瘤淋巴管新生的靶向治疗的开发与应用。

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