慢病毒载体过表达SATB1蛋白对乳腺癌细胞侵袭性的影响

孙正魁 张 超 邹学森 徐宗全 姜桂香 董 赟

特殊富含AT序列结合蛋白1(special AT rich sequence binding protein,SATB1)的表达与乳腺癌的不良预后和化疗耐药相关[1]，本研究构建人SATB1 基因慢病毒表达载体，评价其在乳腺癌细胞中的表达水平和对乳腺癌细胞侵袭性的影响，为进一步研究SATB1 在乳腺癌中的作用及机制奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM 培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Hy-clone，美国)；GV287 载体(含绿色荧光蛋白GFP)、pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体、293T细胞、PCR引物(上海吉凯基因技术有限公司)；Taq 聚合酶(Takara，日本)；QIAGEN Plasmid 大抽Kit(QIAGEN，德国)；琼脂糖(北京赛百盛基因技术有限公司)；DNA ladderMarker(上海捷瑞生物工程有限公司)；T4 DNA 连接酶、AgeⅠ、BamHⅠ(NEB，美国)；脂质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美国)；Western blot 检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；SATB1单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)。

1.2 方法

1.2.1 SATB1 基因获取和真核表达载体酶切 参考GeneBank 的SATB1 基因序列(NM-002971.4)设计出合成一对SATB1 基因引物。引物序列：上游引物5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGATCATT

TGAACGAGGCAAC-3'，下游引物5'-TCCTTGTAGTCCATACCGTCTTTCAAATCAGTATTAATGTC-3'。抽提人SATB1cDNA，并以此为模板进行PCR 扩增。

1.2.2 GV287-SATB1 重组质粒构建、扩增、鉴定 通过限制性内切酶AgeⅠ(ACCGGT)和BamH Ⅰ(GGATCC)使慢病毒表达质粒GV287 载体线性化，通过T4 DNA 连接酶将线性化的载体和DNA 构建为带有目的基因SATB1 序列的质粒载体。连接后的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，培养筛选后，挑取单克隆并扩大培养以进行PCR 鉴定及测序。

1.2.3 病毒颗粒包装和浓缩 将对数生长期的293T细胞接种于细胞培养皿，培养24 h使密度达70%～80%，加入所制备的各DNA溶液(GV287-SATB1 20 μg，pHelper 1.0载体15 μg，pHelper 2.0载体10 μg)、相应体积的Opti-MEM、Lipfectamine 2 000试剂(100 μl)。收集转染48 h后的293T细胞上清液。离心除去细胞碎片，过滤上清液，离心得到需要的病毒浓缩体积。分装保存病毒浓缩液，-80℃保存。

1.2.4 病毒转染MCF-7细胞 取处于对数生长期的MCF-7细胞接种于6 孔培养板中，待细胞生长融合约70%左右进行转染。共分为3 组：MCF-7细胞对照组；转染单纯含GFP 病毒液组；转染含有目的基因SATB1组。转染条件：每孔1 mL培养基，含10% 胎牛血清，109 TU/mL 病毒液(7 μL)，转染12 h 后倒去培养基，PBS 清洗，加入2 mL完全培养基，48 h后更换完全培养基，荧光显微镜下检测转染效率。大量扩增细胞，备用。

1.2.5 Western blot 检测SATB1 蛋白表达 以细胞裂解液裂解筛选后的细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白的浓度，制备SDS-PAGE 胶，每泳道加入20 μg总蛋白，电泳。转至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加一抗(SATB1单抗)孵育，4 ℃过夜，次日室温下1 h，PBST 清洗5次，5 min/次，加二抗，室温2 h，PBST 清洗3次，10 min/次;入化学发光剂，暗房曝光。

1.2.6 侵袭实验 采用Transwell小室，取上述3组的细胞，胰酶消化后用DMEM培养液悬浮。调整细胞密度至2.5×105/mL，加200 μL细胞悬液至上室，下室加入30%胎牛血清的DMEM培养液600 μL，每株细胞设3个复孔，24 h后用0.1%结晶紫染色，观察穿过Transwell小室的细胞数量，作为评价侵袭能力的指标。显微镜下计数每个小室的穿膜细胞数，实验重复3次，取均值。

2 结果

2.1 PCR 扩增SATB1

PCR 成功扩增出SATB1 序列的DNA 片段，电泳可见大小约2 333 bp 的特异性条带(图1)。

SATB1为2333bp的扩增条带，M为Marker。

2.2 重组质粒的鉴定

提取重组质粒，以KL5911-P3 / EGFP-N-R为引物进行PCR 扩增，得到910bp 的扩增产物，即阳性克隆(图2) 。阳性克隆测序由上海吉凯基因技术有限公司完成，测序结果与目标序列完全一致。

a为阴性对照(ddH2O)；b为阴性对照(空载体自连对照组)；c为阳性对照(GAPDH)；M为Marker；1～5分别为SATB1 1～5号转化子。

图2 电泳鉴定PCR 产物

2.3 转染MCF-7细胞后荧光显微镜观察结果

以完全培养基筛选2周后大量扩增细胞，倒置荧光显微镜(×200)观察发现，转染后的大部分细胞均有GFP 表达，转染效率达70%以上(图3)。

图3 转染后荧光表达情况(免疫荧光×200)

2.4 Western blot 检测SATB1 表达

将转染后的细胞提取总蛋白，β-actin 作为内参，结果显示SATB1 转染组较空白对照组及GFP对照组SATB1表达水平明显上调(图4)。

Cont为空白对照；GFP-cont为GFP 空质粒转染组；SATB1为目的基因转染组。

图4 Satb2 表达的Western bolt 结果

2.5 SATB1过表达对MCF-7细胞侵袭性的影响

采用Transwell法检测转染GV287-SATB1的MCF-7细胞的穿膜能力，结果显示SATB1 转染组较空白对照组及GFP对照组的穿膜细胞数显著增加，P<0.01(图5)。

Cont为空白对照；GFP-cont为GFP 空质粒转染组；SATB1为目的基因转染组。

图5 SATB1过表达对MCF-7细胞侵袭性的影响

3 讨论

乳腺癌的发病率逐年上升，现居女性恶性肿瘤首位[2]。采用目前治疗方法，疗效仍不尽如人意，重要脏器的转移是造成乳腺癌死亡的原因，与乳腺癌侵袭转移相关的生物学标志物是目前乳腺癌研究的热点。

SATB1是1种组织特异性表达的核基质结合蛋白，编码基因位于3号染色体3P23区，能以非常高的亲和力与核基质结合区的ATC序列相结合，参与染色质重塑、DNA甲基化和组蛋白乙酰化，调控多种基因表达[3]。Han等用免疫组化的方法发现在人乳腺癌组织细胞核中有SATB1的异常显著表达，进一步研究发现表达水平不仅与乳腺癌的恶性程度呈正相关，而且在其表达的同时能上调乳腺组织中1000余种基因的表达，可能成为控制乳腺癌转移的关键蛋白[4]。因此，研究SATB1在乳腺癌组织中的生物功能具有十分重要的意义。

慢病毒表达载体转染细胞具有能够转染非分裂期细胞，体内较长期稳定的表达，免疫反应小，安全性较好等优点[5]。本研究成功构建表达SATB1蛋白的慢病毒载体GV287-SATB1。该慢病毒载体使用的病毒包装系统由GV287、pHelper 1.0和pHelper 2.0组成。其中，GV287质粒中含有PUbi启动子，能在宿主细胞中持续表达SATB1，同时该质粒能表达由PSV40启动子驱动的GFP，可用于病毒包装时转染效率及感染目的细胞的感染效率的检测，pHelper1.0和pHelper2.0载体则表达病毒结构和包装所需要蛋白。

本研究采用的MCF-7乳腺癌细胞株是从一例69岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的，该细胞保留了多个分化乳腺上皮的特性，表达雌激素受体，侵袭性较弱[6]，是在乳腺癌研究中被广泛应用的代表性细胞株。我们发现GV287-SATB1慢病毒载体能够被高效率的转染MCF-7细胞并在MCF-7细胞中过表达SATB1蛋白，过表达SATB1的MCF-7细胞侵袭性显著增强。为进一步研究SATB1基因对人乳腺癌细胞生物学行为的影响并探讨其机制奠定基础。

[1] Yamayoshi A,Yasuhara M,Galande S,et al.Decoy-DNA against special AT-rich sequence binding protein 1 inhibits the growth and invasive ability of human breast cancer〔J〕.Oligonucleotides,2011,21(2):115-121.

[2] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[3] Yamasaki K,Akiba T,Yamasaki T,et al.Structural basis for recognition of the matrix attachment region of DNA by transcription factor SATB1〔J〕.Nucleic Acids Res,2007,35 (15):5073-5084.

[4] Han HJ,Russo J,Kohwi Y,et al.SATB1 reprogrammes gene expression to promote breast tumour growth and metastasis〔J〕.Nature,2008，452 (7184):187-193.

[5] Naldini L,BlomerU,Gallay P,et al.In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector〔J〕.Science,1996,272(5259):263-267.

[6] Lacroix M,Leclercq G.Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours:an update〔J〕.Breast Cancer Res Treat,2004,83(3):249-289.