EGFR抑制剂对裸鼠鳞状食管癌的抑制作用

许双塔 许建华 郑正荣 赵清泉 姚方辉 贺雅莉

(福建医科大学附属第二医院肿瘤科，福建 泉州 362000)

表皮生长因子受体(EGFR)是一类将细胞外信号转导到细胞内的重要途径蛋白受体，具有酪氨酸激酶(TK)的活性。研究证实〔1〕，多数实体瘤，如鳞状食管癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌、喉癌等都存在EGFR蛋白过度表达。现在研究的分子靶向药尤其是抗肿瘤靶向药物主要分为两类〔2〕，OSI-774、IMC-C225均属于EGRF-TK拮抗剂，在头颈部肿瘤中显示出良好的抑制作用〔3〕，但未见对食管癌的研究。本文通过建立鳞状食管癌裸鼠荷瘤模型，研究EGFR抑制剂OSI-774、IMC-C225单药以及联合治疗抗肿瘤的效果。

1 材料与方法

1.1实验材料 雌性裸鼠40只，购自北京利华公司，10～12周龄，体质量20～24 g；鳞状食管癌细胞株(中科院上海生物研究所)；OSI-774(埃罗替尼，罗氏制药)；IMC-C225(西妥昔单抗注射液，德国霍克大药厂)。

1.2实验方法

1.2.1动物模型建立 将鳞状食管癌细胞株悬浮于RPMI-1460(含10%FBS)培养液中，于5%CO2饱和，37℃下传代培养，维持细胞单层生长；收集肿瘤细胞与RPMI制成1∶1的细胞悬浮液，细胞密度为1×108个/ml。用1 ml注射液吸取0.2 ml肿瘤细胞注射在裸鼠皮下，观察1 w，至肿瘤直径>1 cm，进行药物治疗。

1.2.2分组及给药 将40只裸鼠按照随机数字表分为4组，对照组：不进行任何治疗；OSI-774组予OSI-774 30 mg/kg，灌胃给药， 1次/d；IMC-C225组予IMC-C225 50 mg/kg，静脉给药，1次/d；OSI-774联合IMC-C225组(OSI-774、IMC-C225剂量、用药方法同以上两组)。治疗过程中观察裸鼠的体重及生存状态。

1.3观察指标

1.3.1肿瘤体积变化 治疗后第3天开始测量并记录肿瘤体积，以卡尺测量肿瘤最大垂直径(L)与最短直径(D)，计算公式〔4〕：肿瘤体积(V)=(L+D2)/2 mm3，记录肿瘤体积及生长时间，直至肿瘤体积达到3 cm3时，对比生长时间。

1.3.2免疫荧光染色法检测肿瘤组织 治疗1 w后，随机选取4只裸鼠模型，切除完整肿瘤组织，5%甲醛固定，石蜡包埋，用荧光标记的caspase、Ki67标记，荧光显微镜下观察caspase、Ki67的表达。

1.3.3细胞增殖测定 利用荧光染色检测Ki67阳性肿瘤细胞计数(1 000个肿瘤细胞中Ki67阳性肿瘤细胞数)，计算Ki67指数，从而检测肿瘤细胞增殖状态。

1.3.4肿瘤细胞凋亡检测 利用荧光染色的caspase检测细胞凋亡情况，在荧光显微镜下选择caspase阳性细胞分布较均匀的4个区域，计算阳性细胞数，取平均值。

2 结 果

2.1肿瘤细胞生长时间评价 建立的鳞状食管癌裸鼠荷瘤模型在1 w后均正常存活，可以触及肿瘤硬块，平均直径>1 cm。治疗后发现，联合组达到30 m2的时间较其他组明显延长。见表1，图1。

2.2肿瘤细胞增殖评价 对照组Ki67指数最高，荧光染色显示Ki67高表达，提示细胞增殖速度快，生长活跃；OSI-774组、IMC-C225组Ki67相对表达少，细胞增殖受到抑制；OSI774联合IMC-C225组Ki67较前3组下降明显，说明细胞增殖受到明显抑制，见表1。

2.3肿瘤细胞凋亡评价 OSI-774组(5.7±0.4)、IMC-C225组(5.8±0.1)较对照组(3.6±0.2)细胞凋亡明显增加(P=0.022，0.002)，OSI-774联合IMC-C225组(10.9±0.7)较前3组凋亡明显(P=0.006，0.009，0.005)，提示联合组可以起到协同治疗的作用。

表1 4组试验中各项指标对比±s,n=10)

图1 4组治疗后肿瘤体积随时间的变化

3 讨 论

EGFR基因位于人类7号染色体的短臂上，含有28个外显子，长度为118 kb，有1 210个氨基酸编码的糖蛋白(分子量为170 kD)〔5〕。目前发现EGFR突变与多种肿瘤发生有关，主要突变形式为基因点突变、基因扩增、基因插入和基因缺失〔6〕。大量文献提示〔7〕EGFR突变集中于18～22外显子，主要位于EGFR-TK区，其中19外显子多为缺失，占所有突变的47%；21外显子多为基因替代，占所有突变的45%。因此普遍认为这两处突变可以增强肿瘤细胞对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性，并且是EGFR抑制剂治疗的有效预测指标。Paez等〔8〕利用DHPLC检测了100多种肺癌组织，发现了28例突变，其中包含19外显子的缺失和21、22外显子的替代。Mukasa等〔9〕检测70例胰腺癌组织，发现只有2例有20外显子突变，但是却有29例基因扩增，高达41.4%。Noh等〔10〕的一项报告中发现，在59例卵巢癌检测18～22外显子突变情况，发现3例突变，且均为19外显子缺失。

抗肿瘤靶向药物主要分为2类，一类为酪氨酸激酶的抑制剂，主要通过抑制EGRF-TK中酪氨酸激酶的活性来抑制肿瘤的生长；另一类是通过阻断EGRF-配体复合物的形成阻断信号传递，抑制肿瘤生长。其中，OSI-774、IMC-C225均属于EGRF-TK拮抗剂。临床上使用IMC-C225治疗直肠癌取得了良好的效果〔11〕，证实了IMC-C225可以逆转放化疗的抗性，提高患者的生活质量和生存期，且不良反应较低。也有研究证实〔12〕OSI-774联合化疗可以提高头颈部肿瘤患者的局部控制率，减少复发，延长生存期。综合国内外研究报道〔13〕，发现EGFR抑制剂在非小细胞肺癌、头颈部鳞癌、结直肠癌治疗上均取得了巨大的进展，但是同样的药物和方法是否可以应用于其他肿瘤治疗尚需要进一步验证。本研究结果说明OSI-774和IMC-C225联合可以增进疗效。为临床药物治疗及分子靶向药物研究提供一定参考。

4 参考文献

1Benhabbour SR,Luft J C,Kim D,etal.In vitro and in vivo assessment of targeting lipid-based nanoparticles to the epidermal growth factor-receptor (EGFR) using a novel Heptameric Z ～(EGFR) domain〔J〕.J Control Rel,2012;158(1):63-71.

2van der meel R,Oliveira S,Altintas I,etal.Tumor-targeted Nanobullets: Anti-EGFR nanobody-liposome loaded with anti-IGF-1R kinase inhibitor for cancer treatment〔J〕.J Control Rel,2012;159(2):281-9.

3Huang DH,Su L,Peng XH,etal.Quantum dot-based quantification revealed differences in subcellular localization of EGFR and E-cadherin between EGFR-TKI sensitive and insensitive cancer cells〔J〕.Nanotechnology,2009;20(22):225102-9 .

4Morris LG,Taylor BS,Bivona TG,etal.Genomic dissection of the epidermal growth factor receptor (EGFR)/PI3K pathway reveals frequent deletion of the EGFR phosphatase PTPRS in head and neck cancers〔J〕.Proc Nat Acad Sci USA,2011;108(47):19024-9.

5Sebastian M,Sen L,Schierhorn A,etal.Suppression of EGFR Autophosphorylation by FKBP12〔J〕.Biochemistry,2011;50(50):10844-50.

6Chih-Chien C,Chien-Yuh Y,Wen-Shih Huang,etal.Clinical outcome of intersphincteric resection for ultra-low rectal cancer〔J〕.Would J Gastroenteral,2006;12(4):640-3.

7李柱虎,林贞花,Lee MJ,等.TGF-β1对胃癌和耐药性胃癌细胞株的生长抑制与p53和cyclin D1蛋白相关性研究〔J〕.中国现代医学杂志,2006;16(22):3393-6,400.

8Paez JG,Janne PA,Lee JC.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to Gefitinib therapy〔J〕.Science,2004;304(5676):1497-500.

9Mukasa A,Wykosky J,Ligon KL,etal.Mutant EGFR is required for maintenance of glioma growth in vivo,and its ablation leads to escape from receptor dependence〔J〕.Proc Nat Acad Sci USA,2010;107(6):2616-21.

10Noh T,Kook YH,Park Cetal.Block copolymer micelles conjugated with anti-EGFR antibody for targeted delivery of anticancer drug〔J〕.J Polymer Sci,Polymer Chem,2008;46(22):7321-31.

11Gary C,Nogalski MT,Yurochko AD，etal.Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility〔J〕.Proc Nat Acad Sci USA,2009;106(52):22369-74.

12Hun X,Zhang ZJ.Anti-epidermal growth factor receptor (anti-EGFR) antibody conjugated fluorescent nanoparticles probe for breast cancer imaging〔J〕.Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc,2009;74(2):410-4.

13Min K，Yung Ki.Phage Display selection of EGFR-specific antibodies by Capture-Sandwich Panning〔J〕.Biotech Bioproc Eng,2010;15(1):152.