FOXA2在肝细胞癌中的临床意义及其与E-cadherin的相关性

陈俊任 杨定华 孙艳华 韩 庆 张敏杰

(南方医科大学深圳市第二人民医院肝胆外科，广东 广州 510515)

肝细胞癌(HCC)术后复发和转移是导致患者预后不良的主要原因〔1〕，而上皮间质转化(EMT)是HCC术后转移复发的主要机制之一〔2〕。EMT发生主要表现为上皮标志物如E-cadherin和ZO-1表达减少，而间质标志物如Vimentin和N-cadherin表达增加〔3〕，研究证实E-cadherin表达缺失是HCC患者术后早期复发和预后不良的独立预测因素〔4〕。叉头框转录因子A2(FOXA2)属于FOX基因超家族，其在调节胚胎发育过程中发挥重要作用，同时研究证实FOXA2在许多人类肿瘤中表达缺失，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌和食管癌〔5〕。最近的研究表明FOXA2表达缺失促进肺癌和胰腺癌EMT发生，抑制FOXA2导致E-cadherin表达减少，而过表达FOXA2上调E-cadherin表达水平〔6，7〕。本研究应用免疫组化技术检测HCC及其对应癌旁组织中FOXA2与E-cadherin的表达，分析两者表达的相关性，探讨FOXA2在HCC中表达的临床意义。

1 材料与方法

1.1一般资料 78例老年(年龄≥60岁)HCC及对应癌旁组织标本来源于2008年1月至2012年10月在我院肝胆外科接受手术的肝癌患者，所有组织标本都经患者同意后取得。患者男58例，女20例，年龄60～78〔平均(64.6±3.8)〕岁。所有标本经术后病理证实为HCC。病理分级：Ⅰ+Ⅱ级36例，Ⅲ+Ⅳ级42例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期25例。所有患者术前均未接受放、化疗，本课题通过医院伦理委员会批准。

1.2FOXA2和E-cadherin免疫组织化学染色 采用标准生物素-链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)法对4 μm石蜡切片进行染色。切片在60℃烤箱中烘烤60 min，然后经二甲苯脱蜡和再水化，0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)抗原热修复，室温冷却20 min，0.3% Trixon-X100处理30 min，3%双氧水-甲醇封闭内源性过氧化物酶活性，正常血清封闭非特异性结合，切片经FOXA2(1∶250，Abcam，Hong Kong)和E-cadherin(1∶400，BD Biosciences，USA)抗体4℃孵育过夜。冲洗后滴加生物素标记的山羊抗鼠二抗工作液(SP试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育30 min。滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30 min。滴加二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木苏轻度复染。酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。细胞内棕色或棕黄色颗粒为蛋白阳性反应，FOXA2表达主要定位在细胞核，E-cadherin表达主要定位在细胞膜和细胞质，根据阳性细胞百分比进行评分：<10%=0分；10%～30%=1分；31%～50%=2分；>50%=3分，评分≥1分则认为FOXA2或E-cadherin蛋白阳性表达〔8〕。

1.3统计学方法 应用SPSS13.0软件，分类资料采用χ2检验，采用Spearman秩相关检验。

2 结 果

2.1FOXA2和E-cadherin在HCC及对应癌旁组织中的表达 图1可见，FOXA2和E-cadherin蛋白在HCC组织中的阳性表达率为44.9%(35/78)和52.6%(41/78)，而对应癌旁组织中两者表达率为71.8%(56/78)和74.4%(58/78)，差异具有统计学意义(χ2=11.631，P=0.001；χ2=7.989，P=0.005)。

A：FOXA2在癌旁组织中阳性表达；B：FOXA2在HCC组织中阳性表达；C：FOXA2在HCC组织中阴性表达；D：E-cadherin在正常组织中阳性表达；E：E-cadherin在HCC组织中阳性表达；F：E-cadherin在HCC组织中阴性表达

2.2FOXA2与E-cadherin蛋白表达相关性分析 HCC组织中FOXA2与E-cadherin蛋白表达呈显著正相关(r=0.715，P=0.015)。

2.3FOXA2蛋白表达与HCC临床病理特征的相关性 FOXA2蛋白表达与肿瘤数目(χ2=5.552，P=0.018)、血管侵犯(χ2=9.329，P=0.002)和TNM分期(χ2=6.479，P=0.011)有关，而与性别、HBV感染、AFP水平、肿瘤大小、肝硬化和病理分级无关。见表1。

表1 FOXA2蛋白表达与HCC临床病理参数的相关性(n)

3 讨 论

HCC是最常见的肝脏原发恶性肿瘤，是我国发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，因此探索HCC早期诊断及预测术后复发的生物标志物成为改善患者预后的关键〔9〕。Foxa1或者Foxa2基因敲除小鼠分别导致出生后死亡或胚胎死亡，单独或联合敲除Foxa1和Foxa2证实两者对于内胚层来源细胞的终末分化和成熟十分重要，如内分泌胰腺的α细胞，肝脏、肺泡和前列腺腔导管上皮，提示FOXA1/2蛋白对于早期胚胎发育和晚或终末期上皮分化具有决定性作用〔10〕。研究证实在FOXA2在分化不良的胰腺癌中表达水平显著低于分化良好的肿瘤，另外在FOXA2在间质型肺癌细胞中的表达水平显著低于上皮性肺癌细胞〔6，7〕。本研究提示FOXA2与HCC的侵袭转移能力相关，FOXA2可能作为潜在的预测肿瘤术后复发和患者生存期的分子标志物。

E钙黏蛋白(E-cadherin)是钙黏蛋白家族主要成员之一，负责上皮细胞与细胞之间的黏附功能，已经有研究认为钙黏蛋白的正常功能缺失可能是肿瘤细胞去分化以及导致转移潜能增加的重要步骤〔11〕。本研究发现E-cadherin在HCC组织中的表达水平显著低于对应的癌旁组织，这与之前的研究报道一致〔4〕。最近研究在肺癌细胞中发现转化生长因子(TGF-β1)能够下调FOXA2蛋白水平，过表达FOXA2可以减少肿瘤侵袭和抑制TGF-β1诱导的细胞外基质(EMT)〔6〕。另外研究也发现FOXA1/2缺失在胰腺癌EMT过程中发挥重要作用〔7〕。E-cadherin表达减少或缺失是EMT的重要标志之一〔2〕，本研究提示FOXA2可能通过抑制EMT发挥抑制HCC转移的功能。

综上所述，FOXA2和E-cadherin在HCC组织中表达下调且两者表达呈显著正相关，FOXA2低表达与HCC恶性临床病理特征相关，提示FOXA2可能作为HCC潜在的治疗靶点。

4 参考文献

1赵建龙，王胐胐，李世朋，等.VEGF、LYVE-1在肝癌组织中的表达与意义〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(8)：2167-9.

2Reichl P，Haider C，Grubinger M，etal.TGF-β in epithelial to mesenchymal transition and metastasis of liver carcinoma〔J〕.Curr Pharm Res，2012；18(27)：4135-47.

3Espinoza I，Miele L.Deadly crosstalk：Notch signaling at the intersection of EMT and cancer stem cells〔J〕.Cancer Lett，2013；341(1)：41-5.

4Hashiguchi M，Ueno S，Sakoda M，etal.Clinical implication of ZEB-1 and E-cadherin expression in hepatocellular carcinoma (HCC)〔J〕.BMC Cancer，2013；13：572.

5Qi J，Pellecchia M，Ronai ZA.The Siah2-HIF-FoxA2 axis in prostate cancer - new markers and therapeutic opportunities〔J〕.Oncotarget，2010；1(5)：379-85.

6Tang Y，Shu G，Yuan X，etal.FOXA2 functions as a suppressor of tumor metastasis by inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition in human lung cancers〔J〕.Cell Res，2011；21(2)：316-26.

7Song Y，Washington MK，Crawford HC.Loss of FOXA1/2 is essential for the epithelial-to-mesenchymal transition in pancreatic cancer〔J〕.Cancer Res，2010；70(5)：2115-25.

8张 竞，涂康生，周振宇，等.GRAMD4在肝细胞癌中的表达及临床意义〔J〕.细胞与分子免疫学杂志，2013；29(2)：190-3.

9Cao W，Li J，Hu C.Symptom clusters and symptom interference of HCC patients undergoing TACE：a cross-sectional study in China〔J〕.Support Care Cancer，2013；21(2)：475-83.

10Lee CS，Friedman JR，Fulmer JT，etal.The initiation of liver development is dependent on Foxa transcription factors〔J〕.Nature，2005；435(7044)：944-7.

11Canel M，Serrels A，Frame MC，etal.E-cadherin-integrin crosstalk in cancer invasion and metastasis〔J〕.J Cell Sci，2013；126(Pt 2)：393-401.