哮喘小鼠C7-T5节段脊髓后角Kinesin-1的表达

张宝辉 方秀斌 刘晓湘

(中国医科大学神经生物学教研室，辽宁 沈阳 110001)

支气管哮喘发病机制复杂，多种细胞因子在气道炎症发展过程中起重要作用。驱动蛋白(Kinesin)-1在膜性细胞器的运输、有丝分裂、减数分裂、信号转导、微管多聚体的动力学控制、mRNA和蛋白质的运输等方面起着重要作用〔1〕，人类的多种疾病都表现出了驱动蛋白表达异常。研究发现，在人体内，驱动结合蛋白基因的5’端融合到ret基因表达酪氨酸激酶的区域，能够导致甲状腺细胞癌变〔2〕；有研究报道，驱动结合蛋白是白塞病(BD)的相关抗原，因此抗驱动结合蛋白抗体与BD发病机制密切相关，值得深入探索〔3〕。Fridolfsson等〔4〕研究表明驱动结合蛋白可能是再生障碍性贫血病人的自身抗原之一。但是，Kinesin-1在哮喘小鼠C7～T5节段脊髓后角内的表达是否发生变化尚未见文献报道。本研究拟探讨采用免疫荧光和Western印迹方法检测各组小鼠C7～T5节段脊髓后角内kinesin-1的表达变化。

1 材料和方法

1.1实验动物分组及模型制备 雌性BALB/c小鼠20只，由首都医科大学实验动物中心提供。按随机数字表法分为:(1)哮喘组10只，第1天每只小鼠腹腔注射20 μg卵蛋白(OVA)(Sigma公司)和2 mg氢氧化铝混合于0.5 ml PBS中，第8天、15天每只小鼠腹腔注射10 μg OVA和1 mg氢氧化铝混合于0.5 ml PBS中，第16天开始将小鼠置于封闭容器中，给予4% OVA(PBS配成)雾化吸入激发哮喘发作，每天1次，25 min/次，连续7 d。 (2)正常对照组，以PBS代替OVA注射和雾化吸入，其余均与哮喘组相同。各组最后一次激发后24 h处死。

1.2AniRes2005肺功能仪测气道反应性 用0.4%的戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠(80 mg/kg)，疼痛反射消失后固定在小鼠体描箱内操作台上，气管插管，呼吸比15∶10，呼吸频率90次/min，游离颈外静脉，行静脉穿刺，固定针柄，封闭体描箱。乙酰甲胆碱(mAch)用磷酸缓冲液(0.1 mol/L pH 7.4)配成0.025、0.05、0.075、0.1 mg/kg经颈外静脉各注射0.1 ml，记录波形和数据。

1.3免疫荧光 动物用0.4%的戊巴比妥钠腹腔麻醉(40 mg/kg体重)，用4%多聚甲醛灌流固定，将组织后固定24 h，移入30%蔗糖缓冲液中致标本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片机连续切片(片厚8 μm)。冷风干燥后，室温下血清封闭20 min，甩干，滴加一抗-1(购自Santa Cruz公司)工作浓度为1∶150，4 ℃孵育过夜；PBS充分洗涤，滴加工作浓度为1∶100 FITC标记的二抗(购自Sant Crutz公司)，孵育40 min；PBS充分洗涤，甘油封片，用OlympusBX51型荧光显微镜进行观察。绿色荧光为阳性表达。

1.4Western免疫蛋白印迹 动物用0.4%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40 mg/kg)，取C7～T5节段脊神经，置于裂解液中机械匀浆，4 ℃ 17 000 r/min离心1 h，吸出上清液，弃去沉淀。用考马斯亮蓝G250结合法，根据已知牛血清白蛋白溶液的浓度及其吸光度和样品吸光度计算出样品蛋白浓度和加样量。加入样品缓冲液，然后将样品置于沸水浴中加热5 min使蛋白质变性。将制备好的样品置于-20 ℃冰箱备用。制备12%分离胶，4%浓缩胶，用微量加样器将样品加在凝胶表面样品槽中。电泳后湿转至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉TTBS缓冲液4 ℃过夜。一抗Kinesin-1及β-actin(1∶200)室温孵育2 h，洗膜，辣根酶标记羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000,Santa Cruz)室温孵育1 h，洗膜后加入ECL试剂(Santa Cruz)反应1 min，暗室曝光显影后冲洗胶片。凝胶成像分析系统上摄像分析，测得目标带的MOD，进而计算出各组样品目标带的MOD与内参照β-actin MOD的比值。

1.5统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1哮喘模型制作结果 正常对照组雾化吸入生理盐水后无明显哮喘反应，哮喘组动物在雾化吸入OVA 3次后，大部分哮喘发作，表现为呼吸频率加深加快，肋间隙凹陷，刺激性呛咳，表明模型制作成功。

2.2AniRes2005肺功能仪测气道阻力 哮喘组小鼠对mAch的浓度反应曲线明显上移，其呼气阻力(ER)和吸气阻力(IR)显著高于正常对照组(P<0.01)，表明哮喘小鼠对mAch的气道反应性显著高于正常小鼠，哮喘模型建立成功(图1)。

2.3免疫荧光结果 从哮喘组小鼠C7～T5节段脊髓的免疫荧光图片上可以看到较强的Kinesin-1的荧光表达，而正常组小鼠C7～T5节段脊髓的免疫荧光表达较弱(图2)，说明Kinesin-1的阳性表达较少;图像分析结果表明，哮喘组小鼠Kinesin-1蛋白的荧光表达平均光密度值为(28.22±2.95),正常组小鼠为(16.11±2.03),二者平均光密度值差异显著(P<0.01)。

图1 AinRes 2005 肺功能仪测气道阻力

图2 免疫荧光检测C7-T5节段脊髓组织KLC-1表达

2.4Western印迹结果 对Western印迹结果进行分析光密度值分析，哮喘组小鼠Kinesin-1蛋白表达的MOD值与内参照β-actin的MOD比值为(0.32±0.01),正常对照组小鼠Kinesin-1蛋白表达的MOD值与内参照β-actin的MOD比值为(0.17±0.01),二者相比，平均光密度值差异显著(P<0.01)。见图3。

3 讨 论

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的反复发作的可逆性的气流受限和气道高反应性为特征的气道慢性非特异性炎症性疾病，我国哮喘发病率为1%，其中儿童达3%。近年来支气管哮喘与细胞信号传导的研究一直受到国内外学者的普遍关注。越来越多的研究发现哮喘发生不仅仅与免疫炎症相关,同时神经系统也参与了哮喘的发病。但对于他们之间的相互作用及其机制尚不完全清楚。

驱动蛋白是一种典型的分子马达，由头部、颈部和尾部区域组成，在细胞内以微管为轨道运动。驱动蛋白的头部由两条相同的链组成，每条重链的一端由约340个氨基酸折叠成球状,它是马达与微管蛋白结合和催化ATP水解的部位。其余部分相互盘绕成双股的α螺旋。链的末端结合的轻链，称为驱动蛋白的尾部,用来连接要运送的细胞器，颈部有两个,它们连接在马达域上,并且可以伸屈〔5，6〕。近年研究发现囊泡转运离不开细胞骨架的参与,细胞骨架为囊泡转运提供了轨道，而位于细胞骨架表面的驱动结合蛋白，与囊泡存在相互作用，驱动蛋白能够催化水解ATP为二磷酸腺苷(ADP)和无机磷酸(Pi)，将贮藏在分子中的化学能高效地转化为机械能，产生定向运动，介导囊泡沿微管向正极的运动〔7，8〕。囊泡转运可以实现细胞从胞外获得营养物质,以及胞内的物质转运,可将营养物质输送到细胞各处,并确保功能蛋白准确发挥效用，其功能紊乱会导致多种疾病的发生。而在神经元中，轴突末端到细胞体的距离很长,并且轴突末梢要释放大量的神经递质,所以神经元必须不断合成、供给大量的物质,包括蛋白质、膜,以补充因轴突部位的胞吐而丧失的成分。由于核糖体只存在于细胞体和树突中,所以蛋白质必须在细胞体中合成，然后通过顺向转运转移到轴突。轴突的物质也可通过逆向转运转移到胞体，实现细胞内的物质循环，一旦这一循环遭到破坏，就会引发严重疾病。研究发现，tau纤维丝可以选择性抑制驱动蛋白介导的顺向快速轴突转运(FAT),并引起驱动蛋白与囊泡的解离,使轴突运输发生了障碍,重要物质无法运输到轴突末梢，影响轴突末梢与胞体的交流,致使突触功能失调，导致神经元死亡〔9〕。但是，在哮喘发病机制中，驱动蛋白是否出现功能异常尚未见文献报道。

4 参考文献

1Vale RD，Milligan RA.The way things move：looking under the hood of molecular motor proteins〔J〕.Science,2000;288(5463)：88-95.

2Cho K,Yi H,Desai R,etal.RANBP2 is an allosteric activator of the conventional kinesin-1 motor protein,KIF5 B,in a minimal cell-free system〔J〕.EMBO J,2009;10(5):480-6.

3Wong YL,Dietrich KA,Naber N,etal.The kinesin-1 tail conformationally restricts the nucleotide pocket〔J〕.Biophys J,2009;96:2799-807.

4Fridolfsson HN,Ly N,Meyerzon M,etal.UNC-83 coordinates kinesin-1 and dynein activities at the nuclear envelope during nuclear migration〔J〕.Dev Biol,2010;338(2):237-50.

5DeBoer SR,You YM,Szodorai A,etal.Conventional kinesin holoenzymes are composed of heavy and light chain homodimers〔J〕.Biochemistry,2008;47(15):4535-43.

6Dietrich KA,Sindelar CV,Brewer PD,etal.The kinesin-1 motor protein is regulated by a direct interaction of its head and tail〔J〕.PNAS,2008;(105)26:8938-43.

7Araki Y,Kawano T,Taru1 H,etal.The novel cargo Alcadein induces vesicle association of kinesin-1 motor components and activates axonal transport〔J〕.EMBO J,2007;26:1475-86.

8Fridolfsson HN,Starr DA.Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei〔J〕.J Cell Biol,2010;191(1):115-28.

9LaPointe NE,Morfini G,Piqino G,etal.The amino terminus of tau inhibits kinesin-dependent axonal transport :implications for filament toxicity〔J〕.J Neurosci Res,2009;87:440-51.