九里香含药血清抗软骨细胞凋亡的机制

吴龙火 温慧玲 李加林 郭小华

(赣南医学院药学院，江西 赣州 341000)

软骨细胞发生过度凋亡是骨关节炎(OA)发病机制之一，但关于其分子调控机制还不是很清楚。九里香为芸香科植物九里香的干燥叶和带叶嫩枝，具有行气止痛、活血散瘀、祛风除湿、麻醉镇惊等功效〔1，2〕。现代药理学研究表明，九里香具有抗生育和终止妊娠、抗菌、抗甲状腺肿大、降血糖、麻醉镇静及增强免疫功能等作用〔3〕。近年来有关九里香的实验研究较多，但大多集中在化学成分等研究方面〔4～6〕。中药发挥药效学活性的物质基础，可能是中药提取物中的原型成分，也可能是代谢产物，而只有被吸收入血的化学成分才可能是真正发挥药效的活性物质。

本课题组前期研究表明，九里香叶醇提物具有显著的抗炎镇痛活性，具有防治OA作用〔7〕。在中国药典2010 年版中，只记载有九里香的显微鉴别和理化鉴别〔8〕。目前，九里香药材的特征图谱尚未见报道，九里香中发挥抗炎镇痛活性的主要物质基础研究也较少。因此，本课题利用含药血清培养OA软骨细胞，分析其抗凋亡情况。

1 材料与方法

1.1材料 Agilent1100高效液相色谱仪(DAD检测器，美国Agilent公司)；Sartorius BS214-D(北京赛多利斯系统有限公司)；AE240天平(十万分之一)；XW-80A漩涡混合器(上海医科大学仪器厂)；TGL-16G高速离心机(上海手术器械厂)。

乙腈为色谱纯(TEDIA)；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯试剂。九里香药材采自福建漳州，经赣南医学院药学院李加林老师鉴定为九里香的干燥叶和带叶嫩枝。Wistar大鼠，雌雄各半，(200±20)g，均由赣州市实验动物中心提供，合格证号：SCXK(赣)2008-0002。

慈王村山林散养珍珠草鸡产业的发展，使得慈王村在经济发展的同时，其生态环境的改善，水土流失的防范和保护作用明显，贫困村民对荒地、废地的管理对慈王村的农田、耕地起到了良好的屏障作用，对于维护生态平衡、改善全村生态环境、提高综合生产能力、促进现代农业可持续发展起到积极的作用。

TRP通道的发现为疼痛治疗开辟了一个崭新的领域。与以往的镇痛药物不同，以TRP通道为靶点的新型镇痛药物能从源头上消除疼痛的产生。但我们应清楚地认识到，TRP通道组织分布广泛，生理功能多样，以此为靶点的药物在发挥镇痛作用的同时往往伴随着副作用。TRPV1拮抗剂正是因为具有体温过高的不良反应而阻碍了其在临床上的应用。因此，减少此类药物的不良反应将是研发的难点。进一步研究TRP通道在疼痛中的作用对于阐明疼痛的发生机制、治疗及相关药物研发具有重要意义。

超宽带接收机应用到的器件，大部分都是宽带或者高频器件，这些射频器件具有幅频特性，其中宽带放大器的增益随着频率的增高以6 dB每倍频程下降[8-10]；无源器件的插损随频率的升高而增加；同型号的器件套间还存在变化斜率的差异，这些因素叠加起来会造成宽带信道链路增益的波动可达10 db以上，严重影响了系统的正常使用。

术后正常饲养8 w，对其膝关节部分进行光学检查。利用Ⅱ型胶原酶法配合胰蛋白酶进行消化分离，得到正常组及OA组大鼠膝关节软骨细胞后，分别用空白血清及含药血清进行培养，利用流式细胞仪进行凋亡检测。

1.2.1.2含药血清样品的制备 称取九里香浸膏，溶于2%吐温-80溶液，配制成剂量100 mg/kg给予大鼠灌胃。取Wistar大鼠(20只)，禁食12 h(自由饮水)，按照100 mg/kg剂量(中国药典2010版推荐剂量)灌胃7 d，第八天灌胃后1 h，经腹主动脉取血5 ml，静置分离血清，以备培养软骨细胞所用。取新鲜含药血清5 ml，加入乙酸乙酯30 ml萃取3次，合并萃取液，蒸干，甲醇定容至200 μl，0.45 μm微孔滤膜滤过，以备HPLC检测。

1.2.1.3空白血清样品的制备 取Wistar大鼠(20只)，禁食12 h(自由饮水)，按照1.2.1.2项给予等体积的2%吐温-80溶液灌胃7 d，第8天灌胃后1 h，经腹主动脉取血5 ml，静置分离血清，以备培养软骨细胞所用。取新鲜含药血清5 ml，加入乙酸乙酯30 ml萃取三次，合并萃取液，蒸干，甲醇定容至200 μl，0.45 μm微孔滤膜滤过，以备HPLC检测。

1.2方法

（2）施工必须权责分明，使施工人员明确自己的职责，施工出现渗漏问题，往往都是施工不当所引起的所以，在施工中如果工程质量出现了问题，要立刻能够找出责任人，对其进行责任追究，这样可以最大程度的减少施工质量问题的出现。

1.2.2大鼠OA模型的建立及OA软骨细胞的培养 每组6只大鼠适应性饲养1 w后，参照文献〔5〕复制大鼠实验性OA模型。常规消毒，以3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧于手术台上，在无菌条件下在右膝关节内侧纵行切开约2 cm，逐层分离，将膑骨向后向外翻，最大限度屈曲膝关节，显露膝关节腔。用显微器械切断前交叉韧带、内侧负韧带，完整切除内侧半月板后，逐层缝合伤口，分笼饲养，允许自由活动。术后给予青霉素10万U肌肉注射抗炎，连续5 d。

1.2.1.1九里香浸膏样品的制备 精密称取九里香(粉碎，过100目筛)粉末约500 g，放入锥形瓶中，加入75%乙醇5 000 ml，回流提取2 h，浓缩至浸膏85.3 g。取浸膏8.5 g，加甲醇溶解定容至100 ml，过0.45 μm微孔滤膜过滤即得，以备建立指纹图谱所用。

1.2.1样品的制备

1.1 研究对象 收集2013年8月至2016年11月，在潍坊市妇幼保健院行NT、胎儿鼻骨超声检查的单胎胎儿资料共6 729例，存在超声软指标异常者共283例。

2.1九里香含药血清的抗凋亡试验 成功构建大鼠OA模型。利用甲苯胺蓝试剂对软骨细胞进行鉴定(图1)。流式细胞仪检测发现，正常组的凋亡率为9.43%，OA模型未治疗组的凋亡率为37.15%，九里香含药血清组的软骨细胞凋亡率为15.24%，说明九里香含药血清大大降低了软骨细胞的凋亡情况。

展会同期举办了2012中国水利工程机械发展论坛，以“‘十二五’水利基础设施建设与发展”为主，以水利机械行业工作会议、中国工程机械租赁业颁奖庆典、水井钻探设备及高效钻进技术交流论坛三个专业性分论坛为辅，解读“十二五”水利政策，探讨水利建设前沿的技术与应用，对各省水利项目投资与规划、工程融资、设备租赁、新型科技等方面进行深入研讨。年度“50强企业”“十大最具发展潜力企业”“十大风云人物”“十大最具竞争力租赁品牌”的评选活动也在展会期间揭晓。

1.2.4人血成分的初步研究 进一步从原药材中制备分离纯化及进行结构鉴定，通过红外、紫外、质谱和1HNMR和13CNMR进行表证。通过与血清学HPLC进行相对保留时间的比较。

2 结 果

1.2.3色谱条件 色谱柱为迪马AgilentC18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈和水梯度洗脱系统；检测波长为337 nm；柱温为25 ℃；流速为1.0 ml/min；进样量为20 μl。考察不同梯度下色谱峰的分离度以及峰的数目。最后确定梯度洗脱程序为:0～5 min, 5%乙腈; 5～7 min, 18%乙腈;7～12 min, 18%乙腈; 12～22 min, 24%乙腈；22～30 min, 24%乙腈； 30～35 min, 35%乙腈；35～45 min, 35%乙腈；45～50 min, 50%乙腈；50～60 min，50%乙腈；60～80 min，100%乙腈。

2.2各供试样品的HPLC指纹图谱的建立 图2可见，通过对HPLC色谱峰的对比，发现九里香含药血清中有效成分达16种或以上，其中大多数为代谢成分；色谱峰1、3、4、7、9、11与九里香供试液HPLC对照图谱对应，为原型成分，色谱峰2、5、6、8、10、12、13、14、15、16在对照图谱中未出现，推测可能均为代谢产物。

图1 软骨细胞凋亡的流式细胞图

图2 各供试样品的HPLC指纹图谱

2.3主要成分的结构鉴定 分离得到的化合物A：白色粉末(乙醇-水)，mp：195℃～197℃，C19H18O6，紫外线下显亮黄色荧光，盐酸镁粉反应阳性，显淡紫红色。UV λmax(nm)：212，337。IR ν (cm-1)：3 401，1 647，1 605，1 516。EI-MS m/z：343〔M〕+。1H NMR(500 M Hz，CDCl3)：δ7.49(1H，dd，J=9.0，1. 8Hz，6’-H)，7.26(1H，d，J=1.8 Hz，2’-H)，6.92(1H，d，J=9.0 Hz，5’-H)，6.54(1H，s，3-H)，6.56(1H，d，J=2.4 Hz，8-H)，6.34(1H，d，J=2.4 Hz，6-H)，3.96(6H，brs，3’-OMe)，3.95(3H，s，4’-OMe)，3.94(3H，s，5-OMe)，3.90(3H，s，7-OMe)。13C NMR(100 mHz，CDCl3)：δ177.3(C-4)，164.8(C-7)，161.2(C-2)，160.8(C-5)，159.9(C-9)，152.4(C-4’)，148.6(C-3’)，125.2(C-1’)，119.7(C-6’)，112.1(C-5’)，110.3(C-10)，108.9(C-2’)，106.7(C-3)，97.3(C-6)，93.4(C-8)，57.1(OMe-4’)，56.8(OMe -5)，55.9(OMe -3’)，55.2(OMe -7)。结合以上数据分析，与文献〔9〕基本一致，故确定该化合物为九里香酮。分离得到的化合物B：白色粉末(乙醇-水)，mp：118℃～120℃，C15H14O4。异羟肟酸铁反应阳性，紫外灯(365 nm)下呈蓝色荧光。UV λmax(nm)：246，258，322。IR ν (cm-1)：2 964，1 713，1 608，1 498。EI-MS m/z：258 〔M〕+。1H NMR(500 mHz，CDCl3)：δ7.63(1H，d，J=10 Hz，4-H)，7.42(1H，d，J=8.5 Hz，5-H)，6.89(1H，d，J=8.7 Hz，6-H)，6.26(1H，d，J=10 Hz，3-H)，5.2(1H，s，4’ -H)，5.08(1H，s，4’ -H)，3.99(1H，d，J=2.0 Hz，1’-H)，3.97(3H，s，OMe)，3.92(1H，d，J=2.0 Hz，2’-H)，1.87(3H，s，5’-CH3)。13C NMR(100 mHz，CDCl3)：δ162.2(C-2)，160.6(C-7)，154.1(C-10)，143.6(C-3’)，141.6(C-4)，129.2(C-5)，113.7(C-8)，113.1(C-3)，112.8(C-9)，107.9(C-4’)， 60.9(C-2’)，56.6(C-6’)，52.1(C-1’)，17.7(C-5’)。结合以上数据分析，与文献〔10〕基本一致，故确定该化合物为脱水长叶九里香内酯(Phebalosin)。

九里香叶中分离得到的主要成分九里香酮和phebalosin的HPLC色谱图分别对应九里香供试液HPLC对照图谱中的色谱峰9和11，其保留时间分别为40.277 min和47.585 min。见图2。

3 讨 论

本课题组的前期研究结果表明〔7〕，以75%乙醇回流提取2 h的方法最佳。对不同流动相系统及不同检测波长的考察结果表明，本试验在337 nm的检测波长下，以乙腈-水系统梯度洗脱，样品的大部分色谱峰基本分离。同时，对各供试液的稳定性、仪器的精密度和测定方法的重复性进行了考察，均符合相关要求。

中药血清药物化学这种方法是建立在“只有入血成分才可能是药效成分”的假说基础之上的〔11〕，主要是通过分析给药后存在于血清中的成分，确定中药在动物体内的直接作用物质基础；但它们也存在一些局限性〔12〕，如很难确定血清中检测到的所谓“成分”是非活性成分还是活性成分的代谢产物，这些为分离带来困难，也为空间结构鉴定带来困难。小分子化合物在血清中的存在方式可能是游离的，也可能是与转运蛋白结合。在处理血清样品时，考虑到处理方法对色谱峰的干扰影响〔13〕，本试验采用直接加入乙酸乙酯进行多次萃取，合并有机相，干燥、蒸干、甲醇定容，以便获得更多的信息。

九里香叶中的主要有效成分为黄酮类和香豆素类化合物。这两大类化学结构上的酚羟基大部分被醚化，总体极性属于适中范围〔14〕，大部分化合物的保留时间在20～ 60 min。

本实验发现九里香血清药物化学对OA软骨细胞有明显的抗凋亡作用。为进一步研究血清药物化学的成分，我们利用HPLC进行中药图谱和血清图谱的比对，分析血清中可能的化学成分变化。利用硅胶柱层析及半制备HPLC进行跟踪导向分离得到两个化合物，其相对保留时间与图谱中色谱峰9和11基本一致。但色谱峰9和11与中药中分离得到的化合物的相对保留时间一致并不能直接说明就是同一个化合物，需要进一步借用其他相关手段(如LC-MS等)进行鉴定。另外，对于其中特征峰的研究也有待进一步系统化，从整体上把握中药内“有效组分群”协同作用的特性〔15〕。

4 参考文献

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15卓 越, 王新春, 甘永祥, 等. 大鼠在体肠吸收筛选甘草黄酮抗HIV活性成分可行性研究〔J〕. 中成药，2009;5(5):715-7.