单核细胞趋化蛋白-1基因多态性与青海藏族肺结核易感性的关系

杨青岩 杨发满 李 军 李晓平 汪远浚 张培莉 高 慧

(青海大学附属医院老年科，青海 西宁 810001)

结核病是一种复杂疾病，研究表明，遗传因素决定结核发病的可能性〔1〕。17q 11.2染色体区域与结核病易感性连锁〔2〕，此区域编码包括单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及几种趋化因子在结核病的免疫反应中发挥重要作用。MCP-1基因启动因子区-2518位点G/A多态性具有重要的生物学意义〔3〕。国内未见在藏族结核人群中与MCP-1基因-2518位点G/A的GG基因型相关研究，本文拟揭示发病机制，为特异性诊断、生物治疗和疫苗研制提供新的靶点。

1 对象与方法

1.1对象 以西宁市的结核病防治结构为单位，收集结核病医院、青大附院呼吸科、老年病科及玉树州、果洛州等地区疾控中心2011年7月至2012年8月新发肺结核病例60例，年龄16～72岁，中位年龄42岁，其中男44例，女16例，均为初治患者，藏族。肺结核的诊断标准参照文献〔4〕，排除其他传染病及慢性病(如支气管哮喘、肺炎、肝肾疾病、糖尿病、肿瘤、遗传性过敏性疾病等)患者，排除器官移植、获得性免疫缺陷病毒(HIV)感染及长期使用糖皮质激素者，选取同时期在青大附院体检中心体检患者60例为对照，年龄17～72岁，中位年龄42岁，男44例，女16例，均排除肺结核病史，其他排除标准同病例组，均为藏族，以年龄差≤3岁和性别与病例组进行1∶1匹配。

1.2调查内容及方法 由进行过培训的我科医师，应用设计的调查表调查研究对象的年龄、性别、民族、婚姻、职业、文化程度、体重指数、卡介苗接种史、结核患者密切接触史(直接接触亲属、同事和同学中有患结核病者)、吸烟史、饮酒和健身活动、工作环境化学烟雾和粉尘暴露情况、接受卫生宣传教育情况。所有研究对象均签署知情同意书。

1.3主要试剂与仪器 (1) 试剂包括 DNA zol BD Reagent,platinum TaqDNA聚合酶(Invitrogen);异丙醇，75%乙醇(广州化学试剂厂);PvuⅡn内切酶(NEB)；西班牙电泳琼脂糖(BIOWEST),引物均有Invitrogen公司合成。(2)仪器 PCR仪，电泳仪 (Bio-Red),高速离心机，移液器，制冰机(北京长流)漩涡振荡器(江苏其林贝尔)。

1.4实验步骤

1.4.1DNA提取 (1)0.5 ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，加入1 ml DNAzolBP试剂漩涡振荡。(2)加入0.4 ml异丙醇漩涡振荡，室温放置5 min,6 000 r/min离心6 min,去上清；(3)加入0.5 ml DNAzolBD试剂，漩涡震荡至沉淀全部溶解，6 000 r/min离心5 min,去上清。(4)加入1 ml 75%乙醇，吹吸数次混匀沉淀。6 000 r/min离心5 min,去上清，重复一遍。(5)空气干燥5～10 min,加入0.1 ml ddH2O充分溶解。

1.4.2PCR引物 (1)引物: Manocyte chemoattractant protein,MCP-1;正义:5'-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3';长义：5'-GTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3';长度：929 bp;(2)PCR反应体系: 10×PCR缓冲液5 μl; d NTP Mixture (10 mmol/L)1 μl; MgCl2(50 mmol/L)1.5 μl;正义：10 μmol/L 1 μl;反义：10 μmol/L 1 μl;PlatinumR Tag DNA多聚酶0.2 μl;DNA 2 μl;H2O38.3 μl;总共50 μl；(3)PCR 条件 94℃ 2 min; 94℃ 30 s,63℃ 30 s 72℃ 5 min。

1.4.3PCR产物电泳 配置1.5%琼脂糖凝胶，取5 μl PCR产物电泳检测。

1.4.4酶切 ①酶切体系：NE缓冲液4 2 μl，Puv Ⅱ0.5 μl，PCR产物 500 ng(5～10 μl)，H2O Xμl，总共20 μl 。②酶切条件：37℃ 150 min,80℃ 20 min。

1.4.5电泳 配置2%琼脂糖凝胶，取5 μl 酶切产物电泳检测酶切结果。

1.5实验结果 酶切产物电泳显示单一929 bp条带，待检样本MCP-1-2518为A/A型；酶切产物电泳显示223 bp和706 bp两条条带，待检样本MCP-1-2518为G/G型；酶切产物电泳显示929 bp，223 bp和706 bp三条条带则待检样本MCP-1-2518为A/G型。见图1，图2。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行χ2检验、单因素分析和多因素分析。

2 结 果

2.1遗传平衡检验结果 AA、GA和GG基因型在病例组的分布频率分别为分别为12/60(20%)、30/60(50%)和18/60(30%) ,在对照组的分布频率分别为6/60(10%)、12/60(20%)和42/60(70%)(χ2=3.24，P>0.05)。

2.2单因素分析结果 环境因素中有统计学意义的因素有文化程度、卡介苗接种史、结核患者密切接触史、体重指数、心理健康程度、蛋白质及蔬菜摄入、吸烟史、室内环境卫生、工作环境粉尘暴露、劳动强度；两组基因型频率的差异显著(χ2=24.041，P<0.01)

2.3多因素分析结果 介苗接种史、吸烟史、心理健康、卧室人数、居住环境采光情况、工作环境粉尘暴露和家庭人均月收入与-2518MCP-1基因型的表达相关。见表1。

图1 患者组MPC-1-2518实验结果

图2 对照组MCPT1-2518实验结果

表1-2518MCP-1基因型与藏族肺结核发病的多因素回归分析结果

自变量β值标准误 χ2值P值OR值95%CI卡介苗接种史0.6660.19311.891<0.011.9471.333～2.843吸烟史0.5540.1789.688<0.011.740 1.228～2.466心理健康0.1730.1052.737>0.051.1890.969～1.460卧室人数0.3290.10410.079<0.011.3901.130～1.703居室环境采光情况0.2140.1223.079>0.051.2390.975～1.574工作环境粉尘暴露0.1820.0963.637>0.051.2000.995～1.448家庭人均月收入-0.3230.1733.497>0.050.7240.516～1.016基因型 AA--7.3670.025-- GA0.6870.2786.1240.0131.9891.154～3.428 GG0.2280.2680.7240.3951.2570.742～2.127

3 讨 论

目前，筛选易感基因最常用方法为候选基因法〔5〕， MCP-1对单核巨噬细胞具有明显的趋化作用，它是趋化因子CC的亚族成员，可趋化单核、巨噬细胞到炎症反应部位，可由单核细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等分泌。Rovin等〔6〕发现，MCP-1基因2518位点G/A多肽性影响基因转录活性，从AG或GG基因型个体分离出的细胞，较AA个体产生更多的MCP-1,从而可以证实在MCP-1基因启动子区-2518位点为G的个体，相同条件下，较AA个体能产生更多的MCP-1,引起更强大炎症反应。

本研究结果与汉族人群及墨西哥和韩国人人群研究不同〔7〕，如果其 MCP-1 基因中的一个单核苷酸多态性(SNP)携带AG和GG基因型将比携带纯和的AA基因型的人发生活动性结核的概率高出 2.3 ～ 5.4 倍；而在韩国受试者中概率高6.9 倍。在亚洲人亚组实验中，等位基因A与结核病易感性有相关性。由于MCP-1能趋化免疫细胞至感染病灶，因此在结核菌感染早期免疫应答中MCP-1扮演着重要角色。但是，高水平MCP-1蛋白质能抑制免疫应答相关蛋白质白介素(IL)-12的产生，如IL-12表达过低，感染灶免疫细胞不能有效活化，致使机体易遭受病菌入侵。携纯和的 GG 基因型的受试者，血浆中MCP-1 蛋白质量最高，而 IL-12 p40蛋白质含量最低；更容易感染肺结核。造成本研究结果原因可能有以下几点：(1)MCP-1在疾病中的双重作用，就MCP-1生物学功能基因定位和调节信号传导机制及受体的特性及与基因细胞因子和炎性细胞等协同作用研究将为肺结核的病因病学提供更多的资料,MCP-1的调节比较复杂，具有组织的特异性,有关单核细胞趋化性调节的研究进一步研究以细胞因子与种族异质性有关,因此需进一步开展对MCP-1基因多态性、MCP-1浓度及大样本研究；(2) MCP-1 基因可能与其他基因连锁不平衡或相互抵消其对结核病易感性的影响，人类白蛋白抗原与肿瘤坏死因子(TNF)-α相关，而TNF-α与IL-10平衡对控制和传播肺结核起着重要的作用〔8〕；(3)结核病易感性既有遗传因素的影响，也受环境因素的影响，以往研究结果表明，卡介苗接种史或结核病暴露史与TNF-α-238的基因型存在相互作用〔8〕；(4)基因与基因或基因与环境因素之间的相互作用尚有待进行深入研究。

4 参考文献

1Comstock GW.Tuberculosis in twins:a re-analysis of the Prophit survey〔J〕.Am Rev Respir Dis,1978;117(4):621-4.

2Arji N,Busson M,Iraqi G,etal.The MCP-1 (CCL2) -2518 GG genotype is associated with protection against pulmonary tuberculosis in Moroccan patients〔J〕.J Infect Dev Ctries,2012;6(1):73-8.

3杨本付，庄 斌，李 芳,等.单核细胞趋化蛋白-1基因多态性与肺结核易感性的关系〔J〕.中华及结核和呼吸杂志，2009;32(6):455-6.

4Flores-Villanueva PO,Ruiz-Morales JA，Song CH,etal.A functional promoter polymorphism in monocyte chemoattractant protein-1 is associated with increased susceptibility to pulmonary tuberculosis〔J〕.J Exp Med,2005;202(12):1649-58.

5庄 斌，杨本付.人类结核病遗传易感性研究进展〔J〕.中华流行病学杂志，2008;29(11):1153-5.

6Rovin BH,Lu L,Saxena R.A novel polymorphism in the MCP-1 gene regulatory regin that influences MCP-1 expression〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1999;259:344-8.

7Fan HM,Wang Z,Feng FM,etal.Association of TNF-alpha-238G/A and 308G/A gen polymorphisms with pulmonary tuberculosis among patients with coal work′s pneumoconiosis〔J〕.Biomed Environ Sci,2010;23(2):137-45.

8Tamouza R,Labie D.A promotor polymorphism in monocyte chemoattractant is associated with increased susceptibility to pulmonary tuberculosis〔J〕.Med Sci (Paris),2006;22(6-7):571-2.